張 穎，王卓林，張志美，王艷萍，徐倩倩，郭時金，沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600；3.哈爾濱北方森林動物園，黑龍江 哈爾濱150322)

多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)是在基因水平上通過測定多個管家基因的核苷酸序列來發(fā)現(xiàn)細(xì)菌變異的分型方法。多序列位點(diǎn)分型技術(shù)首先于1998年由Maiden等[1]應(yīng)用于革蘭氏陰性病原菌的研究，后來逐漸在許多病源微生物、環(huán)境細(xì)菌和真核生物中得到應(yīng)用。MLST技術(shù)是由多位點(diǎn)酶電泳(multilocus enzyme electro-phoresis, MLEE)技術(shù)發(fā)展而來，MLEE技術(shù)于1966年被首先應(yīng)用，之后被廣泛用于病原微生物的流行病學(xué)研究中，但是由于MLEE方法是基于蛋白質(zhì)水平上的研究，無法檢測出某些核酸水平的變化。MLEE技術(shù)屬于表型分型技術(shù)，是通過生物個體間多位點(diǎn)酶的差異來反映其遺傳上的差異；而MLST技術(shù)不是分析基因的表達(dá)產(chǎn)物，而是分析基因的核苷酸序列。一個基因突變后形成不同的核苷酸序列，突變的核苷酸序列被定義為這個基因的等位基因[2]。此方法具有很多明顯的優(yōu)勢。首先，簡單方便，可重復(fù)性強(qiáng)，只需通過國際互聯(lián)網(wǎng)就能對某一具體致病菌株在全球范圍內(nèi)的傳播分布情況進(jìn)行追蹤監(jiān)控；其次，由于細(xì)菌易出現(xiàn)自發(fā)性突變和與外源性基因的重組整合，克隆常呈現(xiàn)多樣性特征。因此，莢膜多糖分群的傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法不能準(zhǔn)確反映菌株的譜系關(guān)系，已無法滿足細(xì)菌的分子流行病學(xué)研究，只僅僅適用于細(xì)菌性疾病暴發(fā)時的鑒別診斷。MLST技術(shù)則可以分析菌株的譜系關(guān)系，發(fā)現(xiàn)那些用常規(guī)的表型方法不能分型的菌株以及新出現(xiàn)變異的菌株。

MLST技術(shù)對多個管家基因核苷酸序列進(jìn)行直接測序，所選擇的位點(diǎn)序列通常位于管家基因內(nèi)部，從而能夠鑒定其位點(diǎn)上的遺傳變異情況。選擇的管家基因是那些通?？隙ù嬖?，并有足夠的變異度來適應(yīng)在這些位點(diǎn)產(chǎn)生變異的等位基因[3]。管家基因幾乎都有保守性，但不同種屬或同一種不同的菌株之間又有差異即變異性。通過核酸序列的測序可直接反映出管家基因的變異情況。一般都選7個管家基因的DNA序列(450～500 bp)，選取分散于基因組內(nèi)部的多個位點(diǎn)會很大程度地提高區(qū)分能力，并且能夠建立起那些彼此相關(guān)的菌株之間的進(jìn)化軌跡。MLST方法是針對管家基因內(nèi)部序列設(shè)計(jì)引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)和對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，每個位點(diǎn)的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序賦予一個等位基因編號，每一株菌的等位基因編號按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，即這株菌的序列型 ST(sequence type)。這樣得到的每個ST均代表一組單獨(dú)的核酸序列信息，然后再進(jìn)行等位基因圖譜(allelic profile)或序列類型(sequence types, STs)的鑒定，根據(jù)得到的等位基因圖譜使用配對差異矩陣(matrix pair-wise differences)等方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹圖進(jìn)行聚類分析[4]。需要注意的是，一般7個管家基因的內(nèi)部序列才能夠得到一個菌株的等位基因圖譜，且序列一定要與定義的等位基因相一致。序列必須呈線性，而且必須準(zhǔn)確，否則即使一個信息錯誤，都會使菌株從一個已知的突變?yōu)橐粋€未知的等位基因。

1 MLST技術(shù)在無乳鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

無乳鏈球菌(S.agalactiae)又叫B群鏈球菌，是一種人畜共患菌。無乳鏈球菌是一種常見病原菌，能引起動物和人感染，能夠引起羊和奶牛的急、慢性乳房炎，人類敗血癥、腦膜炎、肺炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜炎、泌尿道感染等，也是引起奶牛隱性乳房炎的重要致病菌之一。感染無乳鏈球菌的奶牛所產(chǎn)的乳汁中的乳糖及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成份含量會下降，能直接影響乳品的質(zhì)量，降低奶牛的產(chǎn)奶量；患隱性乳房炎的奶牛乳汁中的無乳鏈球菌及其產(chǎn)生的毒素能直接影響乳品質(zhì)量，食用這樣的乳制品后可引起人嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、脫水等，嚴(yán)重危害食用者健康和公共衛(wèi)生安全。我國食品法明確規(guī)定，應(yīng)用抗生素治療隱性乳房炎后的72～96 h之內(nèi)的乳品不能食用；如長期應(yīng)用抗生素?zé)o乳鏈球菌會產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌會隨著食物鏈進(jìn)行傳播擴(kuò)散，導(dǎo)致消費(fèi)者產(chǎn)生對某種抗生素藥物的耐藥性，給人類的健康和生命安全造成嚴(yán)重的威脅[5]。

MLST技術(shù)在無乳鏈球菌中選用以下7個管家基因：(1)乙醛還原酶，(2)苯丙氨?；鵷RNA合成酶，(3)谷氨酰胺運(yùn)載蛋白，(4)谷氨酰胺合成酶，(5)絲氨酸脫水酶，(6)葡萄糖激酶，(7)酮糖移轉(zhuǎn)酶基因。所用的引物序列和擴(kuò)增長度如表1所示。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表1 無乳鏈球菌管家基因位點(diǎn)的相關(guān)試驗(yàn)參數(shù)Table 1 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S.agalactiae

2 MLST分型技術(shù)在停乳鏈球菌似馬亞種中的相關(guān)參數(shù)

停乳鏈球菌似馬亞種(Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis, SDSE)是一種新出現(xiàn)的全球病菌，屬于C群鏈球菌，一般可感染獸類，致動物出現(xiàn)膿腫、心內(nèi)膜炎及乳腺炎，以前感染人的情況少見，最近幾年才出現(xiàn)感染人的病例報導(dǎo)[6]。此病曾在我國“非典”時期發(fā)生[7]。

MLST技術(shù)在停乳鏈球菌似馬亞種中選用以下7個管家基因，分別是葡萄糖激酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷氨酸消旋酶、DNA錯配修復(fù)蛋白、酮糖移轉(zhuǎn)酶、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乙酰乙酰輔酶A硫解酶。所用的引物序列和擴(kuò)增長度如表2所示。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

3 MLST分型技術(shù)在肺炎鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)為人獸共患菌，主要侵害剛斷奶仔豬，近年來曾多次發(fā)生，無季節(jié)性。發(fā)病率時高時低，與天氣變化有一定聯(lián)系；不及時治療一般會死亡，但肥育豬發(fā)病率和病死率都較低。用恩諾沙星等藥物治療有一定效果，用青霉素治療效果不好[8]。本菌為條件致病菌，約有20%～40%正常的人群和動物的上呼吸道中存在此菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時可發(fā)生內(nèi)源性感染，同時也可發(fā)生外源性感染；可導(dǎo)致人的大葉性肺炎、化膿性胸膜炎、腦膜炎、敗血癥等，因此在本病防治工作中應(yīng)注意人體保護(hù)[9]。

表2 停乳鏈球菌管家基因位點(diǎn)的相關(guān)試驗(yàn)參數(shù)Table 2 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of SDSE

肺炎鏈球菌的MLST數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在包含5000株左右的菌株，MLST技術(shù)在此病中有7個管家基因，分別為莽草素脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、葡萄糖激酶、酮糖移轉(zhuǎn)酶、信號肽酶、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶及D-丙氨酸連接酶。所用的引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小如表3所示。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表3 肺炎鏈球菌管家基因位點(diǎn)的相關(guān)試驗(yàn)參數(shù)Table 3 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S. pneumoniae

4 MLST分型在化膿性鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

化膿性鏈球菌(也稱為A組鏈球菌屬，GAS)是鏈球菌屬中最重要的致病菌，是兒童和成人呼吸道感染的重要病原菌，是具有高度流行性的細(xì)菌性病原體，全世界都有分布，據(jù)目前所知，人類是其唯一的生物學(xué)宿主，多數(shù)時候，GAS易感染外表組織，包括上呼吸道的粘膜上皮組織或皮膚的表皮層，分別導(dǎo)致咽炎或膿皰病[10]。在臨床上常引起急性咽炎、丹毒、膿包病、猩紅熱、醫(yī)源性傷口感染和產(chǎn)后感染等，此外化膿性鏈球菌感染還可發(fā)生急、慢性風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎等嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)性并發(fā)癥[11]。

化膿性鏈球菌的MLST數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在包含超過1000種菌株信息，MLST技術(shù)在化膿性鏈球菌中選用7個管家基因分別是乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖激酶、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、酮糖移轉(zhuǎn)酶、谷氨酸消旋酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移白和DNA錯配修復(fù)蛋白。所用的引物序列和擴(kuò)增長度如表4所示。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表4 化膿鏈球菌管家基因位點(diǎn)的相關(guān)試驗(yàn)參數(shù)Table 4 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of GAS

5 MLST分型技術(shù)在豬鏈球菌中的相關(guān)參數(shù)

豬鏈球菌(S.suis)是革蘭氏陽性菌，豬鏈球菌病是由致病性鏈球菌引起的一種人畜共患急性傳染病，屬國家規(guī)定的二類動物疫病。S.suis作為一個重要的人獸共患致病性病原菌感染宿主后，可導(dǎo)致宿主出現(xiàn)敗血癥、腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等。至今為止，根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，S.suis有35個血清型。所有的血清型都能引起宿主感染，但豬鏈球菌血清2型(SS2)是引起宿主感染的最常見血清型[12]。自1968年丹麥[13]第一次報道有SS2感染人事件到2008年12月份為止，世界上共有400多例人感染病例被報道。1990年，在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)豬群中有類似SS2鏈球菌病的發(fā)生，但未見人與人之間的感染事件。1998～1999年，江蘇省[14]和浙江省的部分地區(qū)，在病豬中分離出豬鏈球菌菌株，經(jīng)鑒定為SS2鏈球菌。2005年6月下旬，四川省資陽、內(nèi)江等地有近80例患者急性發(fā)病，并有12例重癥患者死亡，經(jīng)鑒定后確診為為2型豬鏈球菌感染。2006年入夏以來，我國的浙江、江西、安徽、江蘇、湖南等省的部分地區(qū)出現(xiàn)了以高熱為主要特征的豬病疫情，并迅速蔓延[15]。經(jīng)分離鑒定，有2型豬鏈球菌感染。

MLST豬鏈球菌數(shù)據(jù)庫是由King等建立并發(fā)展充實(shí)的。意大利學(xué)者Princivalli等[16]對2003年至2007年間分離的菌株進(jìn)行MLST研究時發(fā)現(xiàn)，ST1型菌株主導(dǎo)著這幾年的流行。與歐洲報道的相比，我國的分離株則以ST7型為主，其次是ST1型。葉長蕓等[17]對國內(nèi)兩次暴發(fā)(1998年江蘇、2005年四川)的豬鏈球菌菌株進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)114株分離菌株中有106株分離菌株屬于ST7型。王洪敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在5株廣東省人源SS2中有3株屬于ST7型，有2株屬于ST1型。ST7型菌株能刺激機(jī)體T細(xì)胞大量增殖并能誘導(dǎo)致炎因子釋放，并且這個能力比ST1型菌株強(qiáng)[18]。

MLST技術(shù)在豬鏈球菌中選用的7個管家基因分別為5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶、葡萄糖激酶、60 KDa大小的分子伴侶、抗過氧化物、同源重組基因、天冬氨酸激酶及DNA錯配修復(fù)蛋白。所用的引物序列和擴(kuò)增長度如表5所示。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表5 豬鏈球菌管家基因位點(diǎn)的相關(guān)試驗(yàn)參數(shù)Table 5 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S. suis

6 展 望

這種基于核酸序列測定的方法可以準(zhǔn)確地記錄細(xì)菌基因水平上的變異，并且核酸序列可以通過互聯(lián)網(wǎng)方便地傳遞，所以MLST被用于研究細(xì)菌的流行病學(xué)、群體生物學(xué)、致病性和進(jìn)化關(guān)系。MLST作為一種直接在基因水平上對微生物進(jìn)行分型的方法，既適用于分子流行病學(xué)研究，也適用于分子進(jìn)化學(xué)研究。因此，MLST成為近年來發(fā)展迅速的微生物分型方法。

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