劉月月，陶海英，杜以軍，2，王興東，于江，2，趙鵬偉，2，劉思當(dāng)，王金寶*，吳家強(qiáng)，2*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；4.山東省壽光圣城街道畜牧獸醫(yī)管理站，山東 濰坊 262700)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱豬藍(lán)耳病，自2006年發(fā)生由變異毒株引起的高致病性藍(lán)耳病以來(lái)，高致病性藍(lán)耳病病毒已經(jīng)成為我國(guó)豬場(chǎng)流行的優(yōu)勢(shì)毒株，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。近年來(lái)，人們一直致力于豬藍(lán)耳病的免疫學(xué)研究，由于最早研發(fā)的豬藍(lán)耳病滅活苗不能有效遏制該病的發(fā)生流行，豬藍(lán)耳病經(jīng)典毒株弱毒苗、變異毒株致弱苗被廣泛使用[2]。但是，活疫苗的返強(qiáng)、變異、免疫抑制、對(duì)其它疫苗的干擾等問(wèn)題正逐漸顯現(xiàn)。

雖然如此，武華等[3]發(fā)現(xiàn)的豬繁殖與呼吸綜合征TJM-F92減毒活疫苗，經(jīng)大量臨床驗(yàn)證該疫苗能夠提升機(jī)體的細(xì)胞免疫，對(duì)防治PRRSV的感染具有良好的效果。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PRRSV常用的ELISA方法不能有效的區(qū)別流行毒株與疫苗毒株[4]。梅林等[5]設(shè)計(jì)的普通PCR能夠很好的區(qū)分野毒株與疫苗株，但比較費(fèi)時(shí)，且不能對(duì)病毒含量進(jìn)行定量檢測(cè)。而熒光定量PCR不僅具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠?qū)Ω咧虏⌒远局甑暮窟M(jìn)行定量分析，可以在疾病早期對(duì)PRRSV做出診斷[6-7]。

本研究根據(jù)TJM-F92減毒活疫苗與流行毒株Nsp2基因的缺失部位不同，選取Nsp2作為目的片段，旨在建立一步法SYBR Green I qPCR，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)PRRSV流行毒與疫苗毒的鑒別，并為PRRSV隱形感染或者早期診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒 株

PRRSV SX-1分離株、豬乙腦病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等均由本實(shí)驗(yàn)室保存，PRRSV TJM-92株減毒活疫苗購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV SX-1(GQ857656)和PRRSV TJM-F92[8]中Nsp2缺失堿基部位的不同，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為131 bp，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PRRSV(F1):5'- ACCAGGCGTTTCGCATCT-3'；PRRSV(R1): 5'-ACTCTCTGCACTCACGGAAGG-3'；PRRSV(F1 T7): 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGAACCAGGCGTTTCGCATCT-3'。

1.3 病毒RNA 的提取和體外轉(zhuǎn)錄模板的制備

用TRIzol(Invitrogen公司)法提取PRRSV SX-1的RNA。以提取的RNA 為模板, 選用引物F1 T7、R1 經(jīng)一步法RT-PCR(大連寶生物工程有限公司) 擴(kuò)增得到的目的條帶作為體外轉(zhuǎn)錄模板。RT-PCR 擴(kuò)增體系為50 μL:PrimenScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL;2×1 Step Buffer 25 μL;引物F1T7、R1(10 μM)各1 μL;模板3 μL;RNase Free dH2O 18μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min; 95 ℃ 預(yù)變性2 min; 94 ℃變性1 min, 55 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸1 min, 共32個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alphalmager EC型)觀察結(jié)果,并用紫外分光光度計(jì)(Thermo公司)測(cè)其濃度，同時(shí)將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，以確認(rèn)T7啟動(dòng)子序列是否成功連入目的片段中。

1.4 RNA 標(biāo)準(zhǔn)品的合成

按體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說(shuō)明書要求，取1 μL PCR 產(chǎn)物用T7 RNA 聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄, 產(chǎn)物最終溶解于DEPC 水中, 并用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。通過(guò)公式將得到的RNA 換算為拷貝/μL, 用RNase Free Water 進(jìn)行10 倍稀釋, 作為標(biāo)準(zhǔn)品, -80 ℃保存。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV

對(duì)熒光定量PCR的引物濃度、退火溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件探索，以得到最佳的qPCR反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按上述優(yōu)化的條件，選擇109、 108、107、106、105、104拷貝/μL 6個(gè)濃度梯度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，每個(gè)共做3個(gè)重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增，得到各自的動(dòng)力學(xué)曲線，儀器軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(Roche480Ⅱ熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)羅氏公司)。

1.7 敏感性試驗(yàn)

本試驗(yàn)分別以109、 108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行qPCR和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的敏感性。

1.8 特異性試驗(yàn)

以PRRSV TJM-F92株弱毒疫苗、豬乙腦病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)提取的RNA為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，以確定該方法的特異性。

1.9 RNA標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取不同稀釋度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，分別在第1、15、30 d進(jìn)行qPCR檢測(cè)，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，以Ct值的變化作為評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性的指標(biāo)。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)送檢的218份病料和血清(其中86份免疫過(guò)PRRSV TJM-F92株弱毒疫苗)進(jìn)行常規(guī)RT-PCR和qPCR檢測(cè)并比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增片段大小的鑒定

用引物F1T7、R1對(duì)提取的RNA模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，取10 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，擴(kuò)增出的帶T7啟動(dòng)子的目的片段約131 bp, 與預(yù)期片段大小相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示T7啟動(dòng)子已成功連入擴(kuò)增產(chǎn)物，可以在T7聚合酶的作用下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到單鏈RNA。

2.2 RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為384.5 ng/μL。根據(jù)公式將標(biāo)準(zhǔn)品濃度換算為拷貝/μL，并按比例稀釋成1010～101拷貝/μL，- 80℃保存。

圖1 qPCR擴(kuò)增目的條帶 Fig.1 qPCR amplification of target gene M.DL 2 000 DNA Marker ；1.qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL 2 000 DNA Marker；1. amplification product of qPCR

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV方法優(yōu)化

優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×One Step SYBR qPCR Buffer 12.5 μL；PrimScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL；F1、R1引物(10 μM)各1 μL；Rnase Free dH2O 7.5 μL;總RNA 2 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min;95 ℃ 預(yù)變性3 min; 94 ℃10 s,55 ℃ 10 s, 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增, 每個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按上述優(yōu)化條件，選擇109、 108、107、106、105、104拷貝/μL 共6個(gè)梯度濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，熒光定量PCR儀自動(dòng)生成制作動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。結(jié)果顯示各個(gè)稀釋度之間具有良好的重復(fù)性，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=-3.259X+38.55，決定系數(shù)R2=0.998。

循環(huán)數(shù)Cycle numbers

圖3 熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of fluorescent quantitative RT-PCR

2.5 敏感性試驗(yàn)

熒光定量PCR能檢測(cè)出的模板最低濃度為1.0×101拷貝/μL (圖4)，而常規(guī)PCR能檢出最低模板濃度為1.0×103拷貝/μL (圖5)，表明熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高100倍。

循環(huán)數(shù)Cycle numbers

2.6 特異性試驗(yàn)

采用1.0×107拷貝/μL的RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以提取的PRRSV TJM-92、JEV、CSFV、PEDV、TGEV的RNA作為檢測(cè)對(duì)象,進(jìn)行一步法SYBR GreenI qPCR，結(jié)果表明35個(gè)循環(huán)內(nèi)除陽(yáng)性對(duì)照外，其余樣品這些病毒的擴(kuò)增曲線基本為水平線未出現(xiàn)有效的擴(kuò)增信號(hào)。表明該方法有很好的特異性(圖6)，并能夠準(zhǔn)確的區(qū)分PRRSV 弱毒疫苗和野毒感染。

2.7 RNA標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)

RNA標(biāo)準(zhǔn)品在-80 ℃下有較好穩(wěn)定性，不同濃度RNA標(biāo)準(zhǔn)品在不同時(shí)間測(cè)得的Ct值見表1。

由表1可知，不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)均小于2%，說(shuō)明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability tests

2.8 臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)送檢疑似藍(lán)耳病的218份病料和血清(其中86份免疫過(guò)PRRSV減毒活疫苗 TJM-F92株)進(jìn)行常規(guī)RT-PCR和qPCR檢測(cè)并對(duì)比。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，免疫過(guò)TJM-F92株弱毒疫苗的豬群發(fā)病率明顯低于未免疫或者免疫其他毒株疫苗的豬群，且qPCR檢出率高于常規(guī)RT-PCR。

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of clinical samples detection

3 討 論

目前，高致病豬藍(lán)耳病病毒已成為優(yōu)勢(shì)流行毒株。PRRSV的基因組全長(zhǎng)約15 kb，含有九個(gè)開放閱讀框(ORFs)，其中以Nsp2的變異最大[9]。不同PRRSV間存在著長(zhǎng)度不一的缺失，因而對(duì)Nsp2的分析在一定程度上可以反映病毒基因組序列的變異情況[10]。而我國(guó)流行的高致病性藍(lán)耳病病毒在Nsp2基因的482和534～562位缺失了1個(gè)和29個(gè)氨基酸，TJM-F92減毒活疫苗又在原缺失的基礎(chǔ)上缺失了120個(gè)氨基酸，這為鑒別診斷提供依據(jù)。

本研究在缺失序列處設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，特異性試驗(yàn)也證實(shí)了該引物的高度特異性，可滿足PRRS流行毒株檢測(cè)要求。標(biāo)準(zhǔn)品是熒光定量 PCR 分析方法中最為重要的因素[11]。在研究PRRSV的熒光定量PCR試驗(yàn)時(shí)將目的片段克隆至T載體, 以鑒定正確的質(zhì)粒為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[12-13]，而本試驗(yàn)選用RNA為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)在上游引物的5，端加入T7啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增的目的片段可以直接用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄而獲得，避免了以質(zhì)粒為模板制備標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)程中的連接轉(zhuǎn)化、鑒定等步驟，大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟。試驗(yàn)結(jié)果表明RNA標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性好, -80 ℃保存30 d無(wú)顯著變化。

針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的高致病性PRRSV變異株基因組的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)學(xué)者建立了高致病性PRRSV RT-PCR檢測(cè)技術(shù)[14-15]。本研究采用的一步法SYBR Green I qPCR可在同一反應(yīng)管中連續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，只需要1 h的時(shí)間即可完成檢測(cè)，較普通PCR反應(yīng)時(shí)間縮短2 h，并且不需要普通PCR后的電泳處理，能有效防止污染，避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[16-17]，另外熒光PCR儀能夠在整個(gè)過(guò)程中自動(dòng)記錄讀數(shù)并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量。靈敏性也比普通RT-PCR高出100倍；對(duì)臨床送檢樣品的檢測(cè)結(jié)果也顯示qPCR的檢出率比常規(guī)RT-PCR高出12.9個(gè)百分點(diǎn)。同時(shí)該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)流行毒株含量的定量檢測(cè)。通過(guò)上述結(jié)果均顯示了本試驗(yàn)方法可以很好地用于豬繁殖與呼吸綜合征高致病性流行毒株與弱毒疫苗TJM-F92株的鑒別診斷,從而對(duì)PRRS做出及時(shí)的診斷。

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