郭時金,王艷萍，周春鳳，董 林，徐倩倩，張志美，沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600)

鴨傳染性漿膜炎、豬高熱綜合征、豬鏈球菌病、豬附紅細(xì)胞體病、牛流行性感冒、犬瘟熱、草魚出血病等均是危害動物養(yǎng)殖業(yè)的重大疾病，嚴(yán)重制約著中國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因而積極開展這些溫?zé)岵〉姆乐窝芯抗ぷ骶哂芯薮蟮纳a(chǎn)實(shí)踐意義。

清瘟敗毒顆粒是由石膏、黃連、知母等十四味藥材組成的復(fù)方顆粒制劑，具有瀉火解毒、涼血之功效，中獸醫(yī)上常用于緩解或治療畜禽熱毒發(fā)斑、高熱神昏癥狀[1]。方中重用石膏清熱瀉火，為君藥；知母配合石膏清氣分實(shí)熱，水牛角、地黃、牡丹皮、玄參和赤芍涼血解毒清血分熱，為君藥；黃連、梔子、黃芩和連翹通瀉三焦火熱，為佐藥；桔梗宣肺、載藥上行，淡竹葉清心利尿、導(dǎo)熱下行，甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏瀉火解毒、涼血之功。

清瘟敗毒散在獸醫(yī)臨床上主要用于治療鴨傳染性漿膜炎、豬高熱綜合癥、豬鏈球菌病、犬瘟熱等瘟性烈性疾病。清溫敗毒顆粒是清溫敗毒散的改劑型制劑，目前還未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。黃連是清瘟敗毒顆粒中的重要藥味，其主要藥效成分為鹽酸小檗堿，鹽酸小檗堿的測定方法報道較多，復(fù)方顆粒制劑中鹽酸小檗堿的分離、測定方法也有報道，但應(yīng)用已報道的方法難以將清瘟敗毒顆粒中的鹽酸小檗堿分離開來[2]。本試驗(yàn)擬建立清瘟敗毒顆粒劑中鹽酸小檗堿含量的測定方法，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 儀 器 Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)(含Agilent色譜工作站軟件，安捷倫科技公司)；ALC-210.4型電子天平(北京賽多利斯股份有限公司)。

1.1.2 藥 品 乙腈(色譜醇)，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；磷酸二氫鉀，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

“瘟敗毒顆?！保綎|綠都安特動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20120312、20120321、20120405、20120409、20120412和20120415。鹽酸小檗堿對照品，批號Z0220712，中國藥品生物制品研究所。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) SB-C18液相色譜(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0)；檢測波長為345 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算不低于5000。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液 取鹽酸小檗堿對照品適量，于60 ℃真空干燥至恒重，精密稱定2.000 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含80.0 μg的溶液。準(zhǔn)確量取上述溶液至1、2、2.5、3 mL至5 mL容量瓶中，分別用甲醇稀釋至刻度線，配成濃度為16、32、40、48 μg/mL的系列儲備液。

1.2.2.2 供試品溶液 取清瘟敗毒顆粒粉末6份，每份3.125 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)助溶30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液約1 mL，置樣品瓶中，備用。

1.2.2.3 陰性對照品溶液的制備 取不含各味藥材提取物的顆粒作為陰性對照樣品，依照供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取各濃度鹽酸小檗堿對照品溶液10 μL進(jìn)樣，按照2.1方法檢測，記錄峰面積(Y，以鹽酸小檗堿峰計)為縱坐標(biāo)，以鹽酸小檗堿濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，用峰面積Y對濃度X進(jìn)行回歸處理并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號，濃度為80.00 μg/mL鹽酸小檗堿對照品溶液10 μL，在同樣條件反復(fù)進(jìn)樣6次，記錄鹽酸小檗堿的峰面積。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在同一色譜條件下，精密吸取對照品儲備液10 μL，于0、1、3、6、12、24 h各進(jìn)樣一次進(jìn)行峰面積測定并比較。

1.2.6 空白試驗(yàn) 按處方比例和要求，制成不含清瘟敗毒方劑各味藥物的空白顆粒，精密稱取1 g空白對照顆粒，加入10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按照2.1方法檢測，重復(fù)3次。

1.2.7 回收率試驗(yàn) 利用加樣回收法，測定鹽酸小檗堿含量。精密量取5 mL制備好的供試品溶液放入5 mL容量瓶中，用于顆粒中，另取6份20 mL供試品溶液分別加入準(zhǔn)確稱量的鹽酸小檗堿對照品1.6 mg，立即稱量，超聲處理后，放至冷卻，繼續(xù)稱量，將減失的重量用甲醇補(bǔ)齊。將此6份溶液在已設(shè)定的色譜條件下依次進(jìn)樣10 μL，用以測定含量。

1.2.8 樣品含量的測定 將加樣回收試驗(yàn)中的精密量取的6份供試品溶液5 mL，每份重復(fù)3個水平測定顆粒中鹽酸小檗堿含量，取其平均值作為顆粒中鹽酸小檗堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的專屬性

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，在2.1色譜條件下，供試品中鹽酸小檗堿與對照品色譜峰保留時間一致，并與其他共存成分的分離度良好>1.5，且陰性樣品在相應(yīng)的位置上無色譜峰干擾(見圖1、2、3)。

2.2 線性關(guān)系考察

根據(jù)鹽酸小檗堿在所選色譜條件下峰面積和濃度的關(guān)系，得回歸方程：Y=240.79X-14.034(R2=1)。線性結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在測量范圍內(nèi)與峰面積具有呈良好的線性關(guān)系。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)為1.16%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在同色譜條件下，精密吸取同鹽酸小檗堿對照品溶液10 μL，在0、1、3、6、12、24 h各一次樣進(jìn)行檢測，色譜峰面積的RSD為0.46%，表明鹽酸小檗堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定，同時也說明該試驗(yàn)穩(wěn)定性較好。

2.5 空白試驗(yàn)

在鹽酸小檗堿保留時間點(diǎn)及其附近無雜峰出現(xiàn)，說明該方法下制劑輔料對鹽酸小檗堿的含量測定不會產(chǎn)生干擾。

圖1 鹽酸小檗堿色譜圖Fig. 1 The chromatogram of Berberine hydrochloride

圖2 清瘟敗毒顆粒色譜圖 Fig. 2 The chromatogram of Qingwen Baidu granule

圖3 空白制劑對照色譜圖Fig. 3 The chromatogram of Negative control

2.6 回收率試驗(yàn)

將測定結(jié)果代入回歸方程進(jìn)行分析，平均回收率為99.09%，RSD 為0.343%(見表2)。表明該種方法回收率高，準(zhǔn)確度良好。

2.7 樣品含量測定

樣品含量測定結(jié)果見表3。由表3可知，不同批次，相同工藝制作的清瘟敗毒顆粒中鹽酸小檗堿的含量接近，大約為25 μg/g顆粒。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of repeatability test

表2 加樣回收試驗(yàn)測定結(jié)果(n=6)Table 2 The results of recovery test for samples added

表3 樣品測定結(jié)果(n=6)Table 3 The results of sample test

3 討 論

3.1 方法的選擇

中藥復(fù)方制劑中鹽酸小檗堿含量測定法一般有薄層色譜及HPLC測定法，但因薄層色譜定量法手動操作環(huán)節(jié)較多，人為影響因素大，重現(xiàn)性不好，反之高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高、專屬性強(qiáng)且方法快捷、準(zhǔn)確[3]，所以本試驗(yàn)選擇了HPLC法測定清瘟敗毒顆粒中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果表明本法分離效果良好、簡便快捷、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高且重現(xiàn)性好，可作為該制劑質(zhì)量控制的方法之一。

3.2 流動相的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報道，高效液相色譜法檢測制劑中鹽酸小檗堿含量的方法主要有以下2種系統(tǒng)，即乙腈-磷酸(或磷酸緩沖鹽)系統(tǒng)[3-4]和甲醇-醋酸-三乙胺-水系統(tǒng)[5-6]，后者為四元系統(tǒng)，組成較為復(fù)雜。參考以上方法，通過多次調(diào)整溶劑系統(tǒng)的乙腈和磷酸鹽的比例對制劑中的鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行測定，最后確定以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)的混合溶液為流動相，這與2010版藥典中鹽酸小檗堿的檢測方法相一致[1]。色譜圖表明，鹽酸小檗堿峰與制劑中其他雜峰分離良好，且峰型對稱性良好。

3.3 吸收波長的確定

據(jù)參考文獻(xiàn)報道[7-15]，鹽酸小檗堿含量采用的檢測波長較多，如254 nm、265 nm、350 nm、345 nm、346 nm和349 nm等。本研究對鹽酸小檗堿對照品溶液在分光光度計下進(jìn)行了紫外圖譜掃描，結(jié)果顯示在345 nm為最大吸收波長，這也與2010年版《中華人民共和國獸藥典》檢測波長一致[1]，故選定345 nm為檢測波長。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)所建立的清瘟敗毒顆粒中鹽酸小檗堿的HPLC檢測方法，加樣回收率高，平均回收率為99.09%，RSD為0.34%<2%，在16.0～48.0 μg/mL范圍內(nèi)鹽酸小檗堿的峰面積與含量之間呈直線關(guān)系，方法簡單、快速、靈敏、精確，可應(yīng)用于清瘟敗毒顆粒劑中鹽酸小檗堿的含量測定及清瘟敗毒顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。

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