程秀芳，朱麗梅，李 丹，谷 巍

(山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000)

隨著飼料工業(yè)不斷發(fā)展，動(dòng)物性蛋白原料日漸短缺，因而開(kāi)發(fā)新的植物源蛋白顯得尤為重要。豆粕是應(yīng)用最為廣泛的植物飼料蛋白質(zhì)資源,蛋白質(zhì)含量高,但豆粕的使用僅限于成年動(dòng)物，因?yàn)橛仔蠛茈y消化大豆蛋白。棉粕是棉籽經(jīng)脫殼、加熱、壓扁成薄片用溶劑己烷浸出油后所剩余的副產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量豐富，是優(yōu)良的植物源蛋白，由于棉粕中含有對(duì)動(dòng)物有害的游離棉酚，會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖造成不良影響[1]，也含有難以消化的纖維素、半纖維素、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子[2]，限制了在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。因此，降解棉粕中的游離棉酚并通過(guò)降解蛋白質(zhì)提高氨基酸及小肽含量，最終提高棉粕利用率是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。孫建義等[3]利用單一菌株假絲酵母菌發(fā)酵可對(duì)棉粕進(jìn)行脫毒處理；程福亮等[4]用需氧和厭氧聯(lián)合發(fā)酵提高動(dòng)物性蛋白原料利用率進(jìn)行了初步研究，但用兩株菌進(jìn)行有氧和無(wú)氧聯(lián)合發(fā)酵的研究報(bào)道仍然極少。本研究采用固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵的方法，將枯草芽孢菌納豆菌(BacillussubtilisNDX6)接入豆粕、棉粕中，按不同比例混合后進(jìn)行有氧發(fā)酵，再接入植物乳桿菌(LactobacillusplantarumBLLP)進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，試圖提高氨基酸及小肽的含量，降低棉粕中游離棉酚的含量，為棉粕脫毒處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株分別為枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisNDX6)和植物乳酸桿菌(LactobacillusplantarumBLLP)，由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存，其中枯草芽胞桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，植物乳酸桿菌發(fā)酵用乳酸菌培養(yǎng)基(MRS)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備 (1)枯草芽孢桿菌NDX6菌種子液制備。取經(jīng)過(guò)兩次活化的斜面菌種一環(huán)約0.05 g于裝有100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，待用。取經(jīng)過(guò)兩次活化斜面菌種一環(huán)于盛有100 mL乳酸菌培養(yǎng)基的鹽水瓶中，于37 ℃靜止培養(yǎng)24 h，待用。(2)植物乳酸桿菌BLLP的種子液制備。取經(jīng)過(guò)兩次活化斜面菌種一環(huán)于盛有100 mL乳酸菌培養(yǎng)基的鹽水瓶中，于37 ℃靜止培養(yǎng)24 h。

1.2.2 固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵方法 有氧發(fā)酵配料：稱取一定量的原料，豆粕和棉粕按不同的比例混合，分別測(cè)定各個(gè)配方中的粗蛋白、游離氨基酸和水分，將粗蛋白、游離氨基酸以絕干計(jì)。

將各個(gè)配方的原料混合均勻裝于罐頭瓶中，裝量50 g/瓶，3個(gè)平行樣品，料水比為1∶0.8，121 ℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當(dāng)溫度降至40 ℃左右時(shí)接入BNDX6菌，37 ℃發(fā)酵36 h后，有氧發(fā)酵結(jié)束。取樣，將樣品分成兩部分一部分用于計(jì)數(shù)，一部分樣品50 ℃低溫烘干，測(cè)定游離氨基酸和水分，游離氨基酸以絕干計(jì)。

無(wú)氧發(fā)酵：有氧發(fā)酵結(jié)束，取樣以備檢測(cè)，然后接種植物乳桿菌BLLP，轉(zhuǎn)入無(wú)氧發(fā)酵60 h后結(jié)束，取樣分成兩份，一份用于測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)、pH值，另一份50 ℃低溫烘干后，測(cè)定游離氨基酸、游離棉酚去除率、粗蛋白，聯(lián)合發(fā)酵結(jié)束。

1.2.3 配方最佳比例篩選 在豆粕與棉粕的混合原料中，設(shè)計(jì)六個(gè)配方為A-F，每個(gè)配方3個(gè)平行，豆粕的含量分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%,相對(duì)應(yīng)的棉粕的含量分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%，分別在有氧發(fā)酵和無(wú)氧發(fā)酵后取樣，檢測(cè)游離氨基酸和游離棉酚，取其平均值。

1.2.4 固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線 以有氧發(fā)酵12 h后開(kāi)始取樣，分別在18 h、22 h、26 h、30 h、34 h、38 h、42 h、46 h、50 h取樣，50 ℃低溫烘干，測(cè)定游離氨基酸、游離棉酚。

以厭氧發(fā)酵開(kāi)始起點(diǎn)為0 h，在0 h、24 h 、36 h、48 h、54 h、60 h、66 h、78 h取樣，50 ℃低溫烘干，測(cè)定游離氨基酸和游離棉酚，根據(jù)兩指標(biāo)確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.5 測(cè)定方法 游離氨基酸的測(cè)定(以氮計(jì))采用電位滴定法；

活菌數(shù)測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法；

游離棉酚測(cè)定采用苯胺法(據(jù)國(guó)標(biāo)GB13086-91)

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 棉粕與豆粕最佳比例混合發(fā)酵的篩選

豆粕和棉粕按不同比例混合進(jìn)行有氧發(fā)酵和無(wú)氧發(fā)酵后，測(cè)定游離棉酚、水溶蛋白(游離氨基酸)、活菌數(shù)、pH、粗蛋白，試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2、表3、圖1、圖2。

表1 聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中游離棉酚變化Table 1 Change of free gossypol in the process of fermentation mg/g

注：同行肩標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Values with the same lowercase superscripts in the same column were insignificantly different(P>0.05),those with different lowercase superscripts in the same column were significant difference(P<0.05)﹒The same below.

由表1可知，配方A有氧發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)，游離棉酚降低了約35%，無(wú)氧發(fā)酵前后比較差異顯著(P<0.05)，游離棉酚降低約71%；通過(guò)聯(lián)合發(fā)酵后游離棉酚由6.20 mg/g降到1.18 mg/g約81%；配方B在有氧發(fā)酵前后比較差異顯著(P<0.05)比發(fā)酵前降低了約32%，但在無(wú)氧發(fā)酵后顯著的升高(P<0.05)約15.7%，整個(gè)聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程降低了約21%；而配方C、D、E都有不同程度的升高。因此在游離棉酚的去除方面來(lái)看，以配方A為最佳。

由表2可知，各配方有氧發(fā)酵和無(wú)氧發(fā)酵中游離氨基酸含量都有顯著差異(P<0.05)，配方A在聯(lián)合發(fā)酵后游離氨基酸約升高6.5倍，配方B約升高8.4倍，配方C、D、E、F分別升高9倍、8.8倍，8.0倍和5.4倍。因此，聯(lián)合發(fā)酵能夠提高游離氨基酸的含量。

聯(lián)合發(fā)酵中需氧和厭氧發(fā)酵后活菌數(shù)見(jiàn)圖1。由圖1可知，有氧發(fā)酵后六個(gè)配方的活菌數(shù)并不高，但是經(jīng)過(guò)無(wú)氧發(fā)酵后，配方A、B、C、D、E微生物活菌數(shù)有所升高，配方A升高了約17倍，特別是配方C活菌數(shù)升高了約24倍，因此，無(wú)氧發(fā)酵對(duì)提高活菌數(shù)有很重要的意義。

表2 合發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量變化Table 2 Change of free gossypol in the process of fermentation mg/g

圖1 各配方在有氧發(fā)酵與無(wú)氧發(fā)酵前、后活菌數(shù)變化Fig．1 The formula of living bacteria number changes before and afrer aerobic fermentation and anaerobic fermentation

聯(lián)合發(fā)酵前后pH變化見(jiàn)表3。由表3可知,聯(lián)合發(fā)酵后可以降低飼料的pH。

聯(lián)合發(fā)酵前后粗蛋白的變化見(jiàn)圖2。由圖2知，聯(lián)合發(fā)酵后粗蛋白的含量比聯(lián)合發(fā)酵前的粗蛋白含量都有所提高，其中以配方A和配方F提高的較多分別約為8%、5%。

在有氧發(fā)酵和無(wú)氧發(fā)酵中，6個(gè)配方都能夠顯著地提高游離氨基酸的含量，無(wú)氧發(fā)酵中能夠顯著地提高發(fā)酵物中的活菌數(shù)，降低發(fā)酵物的pH；6個(gè)配方的發(fā)酵過(guò)程中，配方A純棉粕發(fā)酵后的游離棉酚，在有氧發(fā)酵及無(wú)氧發(fā)酵都能夠降解游離棉酚的含量，由原來(lái)的6.2 mg/g降解到1.18 mg/g，比原來(lái)降低了約81%，因此配方A為最佳配方。

表3 發(fā)酵前后pH變化 Table 3 Change of pH before and after fermentation

圖2 聯(lián)合發(fā)酵前后蛋白質(zhì)含量變化Fig．2 Changes of protein content before and after combined fermentation

2.2 聯(lián)合發(fā)酵中有氧發(fā)酵生長(zhǎng)曲線繪制

2.2.1 有氧發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)游離棉酚和游離氨基酸變化曲線 由圖3可知，有氧發(fā)酵中發(fā)酵時(shí)間在30 h后游離氨棉酚明顯降低，游離氨基酸明顯升高，在38 h時(shí)游離棉酚降至最低，以后趨于平穩(wěn)；游離氨基酸在18 h～22 h明顯升高，22 h后逐漸升高，38 h升至最高，以后趨于平穩(wěn)，升高不明顯。綜合兩項(xiàng)指標(biāo)確定發(fā)酵時(shí)間為38 h為有氧發(fā)酵的最佳時(shí)間。

2.2.2 無(wú)氧發(fā)酵中游離棉酚和游離氨基酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線 由圖4知，在無(wú)氧發(fā)酵中，游離棉酚含量在36 h后明顯降低，60 h后趨于平穩(wěn)，66 h降至最低，后又趨于平穩(wěn)；游離氨基酸在24 h后明顯升高，36 h后趨于平緩升高，60 h升至最高，在78 h后下降明顯；因此，在無(wú)氧發(fā)酵中發(fā)酵最佳時(shí)間為60～66 h。游離氨基酸比發(fā)酵前游離氨基酸含量提高6.26倍,游離棉酚降低約80%。

圖3 有氧發(fā)酵中游離棉酚和游離氨基酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化 Fig.3 Changes of the contents of free gossypol and free amino acid in anaerobic fermentation accompanying different fermentation time

圖4 無(wú)氧發(fā)酵中游離氨基酸和游離棉酚隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig. 4 Changes of the anaerobic fermentation of free amino acid and free gossypol content in different fermentation time

3 結(jié) 論

隨著近幾年來(lái)研究的不斷深入，棉酚脫除技術(shù)越來(lái)越多，包括物理法、化學(xué)法、溶劑浸出法、生物脫毒法等。物理法中的高溫法和擠壓法在降低毒性物質(zhì)游離棉酚的同時(shí)，也降低棉籽餅殘油率，從棉籽餅綜合利用角度考慮，此方法受到了限制；添加硫酸亞鐵、尿素、堿、石灰水等也可脫毒即為化學(xué)法，其中最常用的是堿法和硫酸亞鐵法。缺點(diǎn)：只能去除游離棉酚，棉酚總量不會(huì)發(fā)生變化。溶劑浸出法對(duì)飼料加工企業(yè)來(lái)說(shuō)費(fèi)用高不可取。

利用微生物發(fā)酵—枯草芽孢桿菌NDX6不但能夠降低游離棉酚的含量，并且能夠大大降解蛋白、提高游離氨基酸及小肽的含量，提高菌體蛋白的含量，從而提高飼料消化吸收的生物利用度，而且經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。

純棉籽粕利用乳酸菌無(wú)氧條件下發(fā)酵也能夠降解部分游離棉酚，而且無(wú)氧發(fā)酵還能夠降低飼料的pH；提高發(fā)酵飼料中的乳酸菌的活菌數(shù)，增加有益菌；從而能夠酸化動(dòng)物腸道pH，增加優(yōu)勢(shì)菌群，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制有害菌的生長(zhǎng)，有效的預(yù)防動(dòng)物腸道疾病的發(fā)生，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力。pH的降低是由于在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了乳酸、乙酸等小分子的有機(jī)酸，對(duì)酸化動(dòng)物的腸道，抑制病原菌的繁殖起到很重要的意義。

總之，將棉粕利用固體聯(lián)合發(fā)酵可以降低毒素-游離棉酚的含量，降解蛋白、提高飼料吸收利用率，增加腸道優(yōu)勢(shì)菌從而對(duì)動(dòng)物的腸道疾病起到很好的保健作用。

如何將固體聯(lián)合發(fā)酵工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，提高棉粕的利用率，需要怎樣的生產(chǎn)設(shè)備達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

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