苗春柳 ，吳德峰*，謝明星

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中 心微生物實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361026)

對(duì)蝦黃頭病是由黃頭病毒(Yellow head virus, YHV)引起的一種對(duì)蝦傳染性疾病，瀕死對(duì)蝦因?yàn)楦我认侔l(fā)黃而使頭部和胸部外觀呈黃色而起名[1]，我國將其列為二類疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(International office of Epizootic Disease，OIE)將其列為必須申報(bào)的疫病[2]。黃頭病從對(duì)蝦感染到死亡經(jīng)歷的時(shí)間只有幾天時(shí)間，而且傳染率很高，對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的損害很嚴(yán)重。從1990年泰國報(bào)道該病以來，黃頭病對(duì)世界各地的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)都造成了不小的損失。本病在亞洲，美洲，澳大利亞都有發(fā)生，2005年我國也在泰國進(jìn)境的草蝦中檢出了黃頭病毒[3-4]。

病毒學(xué)研究證明，黃頭病毒(Yellow head virus, YHV)是一種桿狀病毒，病毒大小為150～170×40～50 nm，在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞之間有包涵體形成。黃頭病毒的基因組為單股正鏈RNA[5]，長(zhǎng)約26 000核苷酸，主要編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白(22，67，135和170 kDa)，基因序列分析發(fā)現(xiàn)其核酸結(jié)構(gòu)與腮聯(lián)病毒(Gill-associated virus，GAV)相似。病毒顆粒是由3種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的，包括核蛋白p24和囊膜蛋白gp64、gp116[6]。核衣殼呈螺旋型對(duì)稱。

黃頭病毒所在的屬中目前已知的病毒有6種基因型[6]。本病毒離開蝦體后在25 ℃～28 ℃海水中至少還可以存活72 h，在60 ℃ 15 min條件下，0.03 mg/mL氯即可滅活黃頭病毒(Yellow head virus，YHV)。黃頭病毒可以侵襲草蝦的初代淋巴細(xì)胞并附著生長(zhǎng)。

由于目前黃頭病的治療手段還比較缺乏，所以疾病的檢測(cè)和預(yù)防就顯得頗為重要。本研究通過建立液相基因芯片檢測(cè)對(duì)蝦黃頭病的體系，使疾病的檢測(cè)更加快速、有效，為疾病的進(jìn)一步研究和防治提供了良好的保障。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒材料 本試驗(yàn)所涉及的對(duì)蝦病毒樣本來自于廣東。

1.1.2 儀器設(shè)備 高速離心機(jī)購自Sigma公司；WB22型數(shù)控水浴鍋購自Memmert公司；冷凍離心機(jī)購自Biofuge Primo R公司；高電流電泳儀購自Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)(Alphamager，EP)Alpha公司；梯度核酸擴(kuò)增儀(PCR儀)購自Bio-Rad公司；液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)(Liquichip 100) 購自Qiagen公司；電子天平BL610購自Sartorius公司。

1.1.3 主要試劑 TMAC(Tetramethylammonium chloride solution,5M) ,Sarkosyl(N-Lauroylsarcosine sodium salt),Tween-20,EDC[N-(3dimethylaminopro-pyl)-N-ethylcarbodimidehydrochloride]購自Sigma公司；Agarose(LE, Analytical Grade)購自Promega公司；SDS (Biotechnology Grade)購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程有限公司(大連)。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)對(duì)蝦黃頭病病毒編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP116的基因，找出基因中最保守的23～24個(gè)寡核苷酸(oligo nucleotide, nt)作為液相芯片的檢測(cè)探針，在探針的5'端標(biāo)記-NH2。分別在探針的上下游設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物。引物和探針?biāo)蚷nvitrogen公司合成，下游引物XmapR的5'端標(biāo)記生物素，探針Probe 的5' C6端用氨基標(biāo)記，探針的反向互補(bǔ)序列RC-Probe的5'端標(biāo)記生物素，全部HPLC純化。

1.2.2 病毒DNA的獲取和檢測(cè) 用Trizol法提取病毒RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求得到病毒的cDNA；利用PCR方法獲得目的片段進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；90 V電壓下電泳30 min；電泳結(jié)束后，取出含有EB的凝膠，直接放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并拍照記錄結(jié)果。

1.2.3 YHV液相基因芯片檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 寡核苷酸探針與羧基化的熒光編碼微球偶聯(lián) 按照Luminex的推薦，選擇熒光編碼微球之間熒光信號(hào)之間誤讀率最低的2個(gè)熒光編碼微球，分別與YHV GP116基因的特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)。熒光編碼微球與探針的偶聯(lián)方法參照Luminex推薦的操作進(jìn)行。偶聯(lián)后檢測(cè)偶聯(lián)的效率，看探針是否有效地偶聯(lián)到微球上，分別去偶聯(lián)各自特征的微球與標(biāo)記了生物素的探針的反向互補(bǔ)序列(RC-Probe)進(jìn)行雜交反應(yīng)，觀察能否檢測(cè)到信號(hào)，以確定是否有效偶聯(lián)。

1.2.3.2 黃頭病毒液相芯片檢測(cè)體系的建立 為了驗(yàn)證核酸探針偶聯(lián)過的熒光編碼微球與相應(yīng)核酸引物的PCR產(chǎn)物之間的雜交否正確，按照Luminex公司推薦的液相基因芯片檢測(cè)方法，建立75 μL檢測(cè)體系。具體雜交步驟如下：將所有溶液恢復(fù)至室溫，所有有關(guān)偶聯(lián)熒光編碼微球的操作應(yīng)避光進(jìn)行；用新合成的引物XmapF和XmapR以cDNA PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行新的PCR反應(yīng)，具體劑量和條件不變。所得產(chǎn)物用于液相芯片檢測(cè)；用震蕩或超聲波法將各個(gè)偶聯(lián)好探針的熒光編碼微球重懸混勻；取熒光編碼微球10 μL，再次用1.5×TMAC雜交液進(jìn)一步稀釋各種編碼的熒光編碼微球，終濃度為200個(gè)熒光編碼微球/μL；在每個(gè)樣品孔和背景孔，加入33 μL混合熒光編碼微球工作液；對(duì)每個(gè)背景孔，加入17 μL TE(pH8.0)作為空白對(duì)照；對(duì)每個(gè)樣品孔，加入純化的PCR產(chǎn)物5 μL和17 μL TE(pH8.0)，輕輕反復(fù)吹打混勻后蓋上蓋子；將上述混合液放入PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng)：95 ℃ 5 min，52 ℃ 15 min，10000 r/min離心3 min；在離心期間，用1×TMAC雜交液將SA-PE稀釋至2 μg/mL，制成報(bào)告混合液；離心結(jié)束后，棄上清，加入75 μL的報(bào)告混合液，輕輕吹打幾次混勻，于PCR儀上52 ℃孵育5 min。

按照Luminex公司推薦的儀器檢測(cè)步驟，設(shè)置儀器每次只檢測(cè)相應(yīng)編碼的微球，將陶瓷底板預(yù)先加熱至52℃后取樣品上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。再根據(jù)Luminex推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果中每種熒光編碼微球個(gè)數(shù)不少于20個(gè)，并且背景空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度不高于500，表明試驗(yàn)成立，可以進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.3.3 液相芯片檢測(cè)方法靈敏性試驗(yàn) 為了確定液相基因芯片的檢測(cè)靈敏度，將YHV模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋10-9。按所建立液相基因芯片快速高通量檢測(cè)方法，確定液相芯片檢測(cè)基因的靈敏度。

1.2.3.4 特異性試驗(yàn) 分別用各毒株探針與其他毒株的陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，檢測(cè)所設(shè)計(jì)的各個(gè)毒株的探針與各個(gè)毒株做選擇的片段是否逐漸有非特異性雜交反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

圖1中1、2、3為同一RNA樣本的3個(gè)重復(fù)，從感染黃頭病的對(duì)蝦組織病料中提取RNA，利用GP116基因的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到核酸進(jìn)行電泳檢測(cè)出一條特異性的條帶，電泳結(jié)果如圖1所示，長(zhǎng)度與預(yù)期的128 bp相符。

圖1 RT-PCR電泳圖片F(xiàn)ig.1 Electrophoresis images of RT-RCR

2.2 黃頭病毒液相芯片檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果

液相芯片定性比值結(jié)果(Luminex qualitative ratio result, LQRR)等于樣品的校正后的熒光強(qiáng)度中位值(Median florescence intensity,MFI)與空白對(duì)照MFI的平均值(MFIB)的比值，即LQRR=MFI / MFIB。比值結(jié)果大于等于3，則判定為陽性樣本；結(jié)果在2到3之間,則判定為可疑樣本；比值結(jié)果小于2，則判定為陰性樣本。

檢測(cè)結(jié)果顯示，每種參與計(jì)數(shù)的熒光編碼微球數(shù)都大于20個(gè)，檢測(cè)結(jié)果有效并且所產(chǎn)生的MFI值可信；空白對(duì)照組的每種熒光編碼微球的MFI值都小于500，表明檢測(cè)結(jié)果有效，收集的數(shù)據(jù)可用于結(jié)果判定；病毒基因的RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的MFI值 明顯大于陰性樣本和空白對(duì)照樣本的值。核酸探針與相應(yīng)引物的RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物之間均有特異性的雜交，液相芯片定性比值結(jié)果(LQRR)都大于3，表明結(jié)果均為陽性(見表1)。

表1 液相基因芯片檢測(cè)MFI值Table 1 The MFI value of liquid gene chip detection

2.3 液相芯片檢測(cè)方法靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

病料提取RNA，然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后10倍梯度稀釋用于液相芯片的靈敏性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明：液相基因芯片檢測(cè)方法檢測(cè)YHV基因的靈敏度為10-6，LQRR值約為3.38(數(shù)據(jù)見表2)。

表2 液相基因芯片檢測(cè)靈敏度的試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The sensitive result of liquid gene chip

2.4 液相芯片檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)YHV，TSV，IHNNV三種不同病毒的基因作為樣品，檢測(cè)結(jié)果顯示核酸探針與相應(yīng)引物的RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物之間均有特異性的雜交，YHV的液相芯片定性比值結(jié)果都大于3，表明檢測(cè)結(jié)果均為陽性，而TSV，IHNNV的液相芯片定性比值結(jié)果都小于2，并且空白對(duì)照的值都很低，證明了試驗(yàn)所建立的液相基因芯片檢測(cè)方法的特異性顯著，檢測(cè)方法成立(結(jié)果見表3)。

表3 液相芯片檢測(cè)特異性的試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The specific result of of liquid gene chip

3 討 論

3.1 液相芯片技術(shù)檢測(cè)對(duì)蝦黃頭病的現(xiàn)實(shí)意義

對(duì)蝦黃頭病作為威脅對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要疾病，迄今為止，尚沒有特異的治療方案和藥劑，只能在源頭上控制疾病的發(fā)生，這就需要特異、靈敏的技術(shù)對(duì)疾病進(jìn)行檢測(cè)，本試驗(yàn)采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)對(duì)蝦黃頭病，成功建立了以GP116基因與熒光微球的偶聯(lián)為基礎(chǔ)的液相芯片檢測(cè)體系。從特異性和靈敏度方面都說明了此種方法對(duì)檢測(cè)對(duì)蝦黃頭病是行之有效的。

3.2 影響PCR結(jié)果的因素

引物優(yōu)劣程度直接關(guān)系到PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增是否成功。變性溫度一般選擇90 ℃～95 ℃。引物退火溫度決定著PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增產(chǎn)量。延伸溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的反應(yīng)最適溫度，一般取70 ℃～75 ℃。常規(guī)PCR一次反應(yīng)一般為25～40個(gè)循環(huán)周期。DNA聚合酶在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。

3.3 液相基因芯片反應(yīng)體系的建立

Luminex液相芯片技術(shù)的基礎(chǔ)是聚苯乙烯微球，這些微球標(biāo)記不同熒光染料。每種微球因?yàn)楦髯詿晒獗壤煌?，具有不同光譜特征，可被激光特異性識(shí)別[7]。分析過程中，不同編號(hào)的微球先與不同的探針分子偶聯(lián)，然后與檢測(cè)樣品中的目的分子和帶有熒光的報(bào)告分子結(jié)合。檢測(cè)時(shí)，Luninex100檢測(cè)系統(tǒng)將微球依次單個(gè)送入檢測(cè)通道，每個(gè)微球單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)。由于每種編碼微球可被特異性地識(shí)別出來，所以可將不同的編碼微球與相應(yīng)的核酸探針分子偶聯(lián)并混合在一個(gè)反應(yīng)體系中。

液相芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：高通量；靈敏性高；樣本用量少，反應(yīng)時(shí)間短；操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高；特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈活；成本較低。同時(shí)，這種檢測(cè)方法也存在一些不足之處，如偶聯(lián)條件的最優(yōu)化、多種反應(yīng)混合在一起交叉反應(yīng)的避免、輸出數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析的優(yōu)化等，還需要進(jìn)一步地提高。

液相芯片技術(shù)的應(yīng)用主要包括兩方面：基因液相芯片和蛋白質(zhì)液相芯片，前者是基于核酸雜交建立起來的，而后者反應(yīng)基礎(chǔ)是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)[8]。目前, 對(duì)于液相基因芯片的開發(fā)已經(jīng)比較成熟，而且實(shí)際應(yīng)用也比較多。由于液相芯片技術(shù)的高通量、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在將來的核酸和蛋白質(zhì)科研和臨床檢測(cè)方面必定會(huì)有很大的發(fā)展空間[9]。隨著科學(xué)技術(shù)的深入，計(jì)算機(jī)軟件功能的逐漸完善和檢測(cè)技術(shù)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)日益豐富，液相芯片技術(shù)必將會(huì)更廣泛的用于各種科學(xué)研究和臨床檢測(cè)中[10]。

3.4 液相芯片技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展前景

液相芯片技術(shù)的應(yīng)用主要包括兩方面：基因液相芯片和蛋白質(zhì)液相芯片，前者是基于核酸雜交建立起來的，而后者反應(yīng)基礎(chǔ)是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)[11]。帶有羧基的熒光微球可以和核酸探針偶聯(lián)，再結(jié)合需要檢測(cè)的DNA片段，最后包被報(bào)告熒光試劑，就可以檢測(cè)樣本中是否有目的核酸分子。此外，聚苯乙烯微球在NHS和EDC活化后可以和氨基以共價(jià)鍵結(jié)合，然后就可以偶聯(lián)蛋白質(zhì)探針，檢測(cè)樣本中是否有目的蛋白[12]。

目前, 對(duì)于液相基因芯片的開發(fā)已經(jīng)比較成熟，而且實(shí)際操作也比較多?？茖W(xué)研究方面，該技術(shù)在基因序列分析和SNP分析等方面運(yùn)用比較廣泛；臨床應(yīng)用上，該技術(shù)已被制作成試劑盒用來檢測(cè)多種病原體[13]。由于液相芯片技術(shù)的高通量、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在將來的核酸和蛋白質(zhì)科研和臨床檢測(cè)方面必定會(huì)有很大的發(fā)展空間[14]。隨著科學(xué)技術(shù)的深入，計(jì)算機(jī)軟件功能的逐漸完善和檢測(cè)技術(shù)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)日益豐富，液相芯片技術(shù)必將會(huì)更廣泛地用于各種科學(xué)研究和臨床檢測(cè)中[15]。

4 結(jié) 論

通過國內(nèi)外最新研究成果，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物。優(yōu)化了PCR反應(yīng)的退火溫度、Mg2+濃度、循環(huán)數(shù)等參數(shù)，得到了需要的DNA片段。

選擇兩種高效的熒光編碼微球，通過與探針的偶聯(lián)和目的基因片段的檢測(cè)，證明了試驗(yàn)的可行性。

建立了對(duì)蝦黃頭病液相基因芯片檢測(cè)體系，成功檢測(cè)出黃頭病毒的GP116基因，對(duì)各個(gè)條件的進(jìn)一步優(yōu)化，以便將來用于實(shí)踐操作檢測(cè)對(duì)蝦黃頭病毒。

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