韓永升 韓詠竹△ 徐 磊 劉向國 付曉明 胡紀源

（1.安徽中醫(yī)學院神經病學研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233004；3.安徽中醫(yī)學院中西醫(yī)結合臨床學院，安徽 合肥 230038）

缺血性腦血管病是威脅人類健康的重大疾病，研究表明當腦缺血發(fā)生時，缺血側半球血管新生增加，這些增加的血管可能來自于腦血管內皮細胞的增殖形成的新生毛細血管［1-2］。為進一步了解電針早期治療缺血性腦血管的機制，筆者通過探討電針早期治療對大鼠腦梗死灶周圍血管內皮細胞生長因子（VEGF）表達的影響，為臨床應用電針早期治療缺血性腦血管病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 分組選取健康成年雄性SD大鼠48只，體質量250～280 g，由上海西普爾-必凱驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2008-0016，實驗條件下自然飼養(yǎng)，預適應環(huán)境1周后進行實驗。大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、電針組各16只。每組又分為7、14 d兩個亞組，每個亞組各8只。

1.2 儀器與試劑 上海產G6805電針儀；德國徠卡RM2016輪轉式切片機；日本OlympusBX51顯微鏡；免疫組化試劑盒SP-9000購自北京中杉金橋生物技術有限公司；VEGF抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 模型制備 采用Zea Longa［3］方法并加以改進，制備急性腦缺血再灌注大鼠模型。假手術組只分離動脈，不結扎、插線。大鼠蘇醒后參照 Zea Longa［3］方法評分。0分：未見神經病學征象，無神經功能缺損癥狀。1分：大鼠被提尾倒懸時，病灶右側前肢呈屈曲、抬高狀態(tài)，不能伸展右側前爪。2分：有向癱瘓側旋轉的征象，即行走右側轉圈。3分：有向病灶對側跌倒的征象，即行走困難并向右側傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識水平呈下降狀態(tài)。達到1～3分為造模成功，采用差額補充的方法以保證每組實驗動物例數。

1.4 干預方法 電針組：造模成功后用自制鼠夾固定，不麻醉。根據華興邦等［4］制定的大鼠針灸穴位圖譜，選穴雙側內關（手厥陰心包經）、水溝（督脈）、雙側三陰交（足太陰脾經）、百會（督脈）。采用蘇州產華佗牌毫針，規(guī)格為直徑0.2 mm，針身0.25～0.5寸。先直刺雙側內關1 mm至筋間，繼刺水溝，在鼻中隔下部向上斜刺水溝1 mm，其次刺三陰交，直刺5 mm，最后向前或向后斜刺百會穴2 mm，留針30 min，留針期間將內關、三陰交穴位針柄分別連接至G6805電針儀，施以疏密波，頻率2/100 Hz，電壓2～4 V，強度逐漸加大到大鼠針刺部位輕微抖動為度，首次針刺在動物造模成功90 min后進行，其后每日上午針刺1次，每7日為1個療程。模型組、假手術組：常規(guī)飼養(yǎng)于籠內，不進行任何干預治療。

1.5 指標檢測

1.5.1 神經功能評定 參照Zea Longa［3］神經功能評分標準評分。在造模成功第7日、14日分別進行神經功能評分，觀察其運動功能恢復情況。

1.5.2 標本采集與檢測 各組大鼠分別于7 d，14 d，隨機取8只。用6%水合氯醛腹腔內注射麻醉后固定于手術臺，剪開胸腔，仔細剪開心包膜，暴露心臟，在心尖處剪一小切口，用9號針頭插入左心室，灌注0.9%氯化鈉注射液，待右心耳膨起，剪開右心耳使血液流出，至右心耳流出液為無色透明時開始用4%多聚甲醛灌注固定。固定后立即剖顱取腦，在視交叉處切開，冠狀切取2 mm厚包含梗死灶區(qū)域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定。在梗死區(qū)取約0.5 mm厚腦組織50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm。切片備用。（1）腦組織HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟入水后，將切片置于蘇木素染液中5 min染色，水洗去多余染料；將切片先后置于碳酸鋰溶液與1%鹽酸酒精中數秒至細胞核變藍；再置1%伊紅水溶液中浸泡5 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后用中性塑膠封片，Olympus BX51顯微鏡下觀察并攝片。（2）免疫組織化學染色：使用SP方法檢測大鼠腦組織中VEGF的表達。免疫組化染色步驟如下。①石蠟切片經常規(guī)脫蠟脫水；②熱修復抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），電爐加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后再加熱至沸騰，反復2次；室溫冷卻后，0.1 mol/L PBS洗滌2次；③置于3%H2O2去離子水孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶，PBS沖洗，每次3 min，共3次；④滴加試劑A（正常山羊血清）封閉液室溫孵育15 min，傾去；⑤分別滴加1∶200比例稀釋的一抗GAP-43、Nogo-A，4℃過夜，PBS沖洗，每次 3 min，共 3次；⑥滴加試劑B（生物素標記山羊抗兔IgG），37℃孵育15 min，PBS沖洗，每次 3 min，共3次；⑦滴加試劑 C（辣根酶標記鏈酶卵白素工作液），37℃孵育15 min，PBS沖洗，每次3 min，共3次；⑧滴加DAB顯色試劑，室溫顯色，顯微鏡下控制反應時間，顯色后，蒸餾水洗滌終止反應。⑨蘇木素輕度復染，自來水水洗；1%鹽酸酒精稍分色后蘭化片刻；常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。用正常山羊血清替代一抗作陰性對照。Olympus BX51顯微鏡觀察并攝片，采用JD801形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)對VEGF的表達進行分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，成組、成對資料均數比較采用t檢驗，多組間比較采用onewayANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 見表1。假手術組大鼠無神經功能缺損癥狀。模型組和電針組比較，造模成功7 d，神經功能評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），14 d時電針組大鼠神經功能恢復明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

2.2 腦組織病理改變 見圖1。電針治療14 d時，假手術組大鼠腦組織灰、白質界限清楚，無缺血壞死區(qū)，組織結構正常，胞膜完整，胞漿著色均勻，細胞核清楚，核仁明顯；海馬結構正常，神經細胞排列整齊緊密。模型組大鼠腦組織灰質區(qū)部分神經細胞及膠質細胞壞死、消失，白質區(qū)部分神經纖維液化壞死；海馬神經細胞排列紊亂，數量減少，細胞變形。電針組大鼠腦組織白質部分神經纖維輕度液化壞死，灰質區(qū)少量神經細胞及膠質細胞壞死，壞死區(qū)膠質細胞廣泛增生。海馬神經細胞排列較整齊，數量輕度減少。

表1 各組大鼠缺血再灌注后神經功能評分比較（分，）

表1 各組大鼠缺血再灌注后神經功能評分比較（分，）

與模型組同時期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組同時期比較，△P＜0.01。下同。

圖1 各組大鼠14 d時腦組織病理變化（HE，×400）

2.3 各組大鼠再灌注區(qū)腦組織VEGF表達比較 見表2。在假手術組中見少量VEGF陽性表達，模型組在腦梗死模型建立7 d時，腦缺血區(qū)VEGF陽性表達增加；14 d時明顯增加，與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。電針組在各個時間點VEGF陽性表達較模型組明顯增加，與模型組比較有明顯差異 （P＜0.01）。

表2 各組大鼠腦內VEGF表達比較（）

表2 各組大鼠腦內VEGF表達比較（）

3 討 論

本研究大鼠針刺選用天津中醫(yī)藥大學石學敏院士創(chuàng)立的“醒腦開竅”針刺法。該針法的主要穴位水溝、內關、三陰交可促進腦的代謝和修復，改善大腦的生理功能，達到“醒神開竅”之功。百會穴具有醒腦開竅、安神定志、升陽舉陷的作用。對中風偏癱患者的大腦皮層的中樞生物電有良好的調節(jié)作用。故本次實驗選取水溝、內關、三陰交為主穴，百會為配穴。有研究表明［5-6］，電針刺激水溝穴、百會穴及內關穴，療效明顯。因此本研究選用電針方法以量化針刺強度，改善療效。

神經行為學評分是腦梗死診斷和療效評價的一個重要指標。本次實驗神經功能評估參照Zea Longa［3］神經功能評分標準評分。將各個亞組的大鼠在各個時間點灌注之前進行神經功能評分。結果提示電針組大鼠神經功能恢復明顯優(yōu)于模型組，說明電針可以明顯促進大鼠局灶性腦缺血模型的神經功能恢復。

VEGF是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂原和血管源性因子，可誘導內皮細胞增殖及毛細血管瓣生成，促進新生血管生成。VEGF不僅可以誘導內皮細胞的增殖、促進微血管的形成，還能直接作用于多種類型的神經細胞，發(fā)揮神經營養(yǎng)及保護作用，可增強細胞活性和存活能力，并能促進軸突再生［7］。VEGF在正常腦組織中僅有少量表達，腦缺血發(fā)生后，促使VEGF表達升高，特別在海馬、皮質對缺血敏感的神經元。本研究表明，缺血早期內皮細胞增生，免疫組織化學染色發(fā)現VEGF表達于星形膠質細胞、神經元及血管內皮細胞，可見血管增生，說明VEGF有促進血管新生作用，有利于側支循環(huán)的建立；神經元及星形膠質細胞可分泌VEGF，提示可能有促進內皮細胞增生的作用，與以往研究一致［8］。本研究表明，缺血組大鼠VEGF在缺血14 d達到高峰，1～3個月VEGF表達有下降趨勢，提示機體自身修復可能達到一個相對平衡狀態(tài)。假手術組僅見少量的VEGF表達，但模型組在7、14 d的VEGF表達明顯高于假手術組，說明在腦缺血發(fā)生后VEGF會參與神經損傷部位血管的再生，促進神經再生和神經保護作用。電針組在7、14 d的VEGF表達均高于模型組，進一步提示了電針在改善腦局灶性缺血再灌注大鼠神經功能中的重要作用，揭示電針治療腦梗死的作用機制，可能是通過誘導細胞表達VEGF而實現的。

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