楊 鶯 吳鳳蘭

（1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.解放軍96101部隊機關(guān)衛(wèi)生所，遼寧 沈陽 110033）

近年來，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入術(shù)（PCI）已成為治療冠心病的主要手段之一，但術(shù)后再狹窄（RS）已成為影響冠心病徹底治療和PCI后長期效果的主要障礙。VSMC增殖是PCI術(shù)后RS形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VSMC增殖是PCI術(shù)后新生內(nèi)膜的主要組成成分，是導致PCI術(shù)后RS形成機制的主要病因之一。本實驗探討中藥欣舒注射液對VSMC增殖、細胞周期的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 新西蘭大耳白兔，4周齡，雄性，體質(zhì)量0.5 kg，購自遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心。作細胞培養(yǎng)用。

1.2 試劑 試劑1：20%FBS（FBS購自天津灝洋生物制品有限公司），DMEM，高糖，雙抗，Hepes，NaHCO3。試劑 2：10%FBS，DMEM，高糖，雙抗，Hepes，NaHCO3。試 劑 3：0.01 mol，pH 7.4，PBS 配 制 ：NaCL 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g， 用雙蒸水依次溶解、添加，最后使總量為1000 mL，pH為7.4，高壓，4℃保存。試劑4：消化液配制：用PBS配制，4℃過夜，溶解。Tripsin（胰酶）：0.25/100 mL，EDTA 0.04/100 mL。

1.3 含藥血清制備

1.3.1 動物 健康新西蘭大耳白兔48只，月齡6～8個月，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。作藥物血清制備用。

1.3.2 藥物 中藥欣舒注射液，由人參、麥冬、川芎組成，每 1 mL含總皂苷以人參皂苷Re（C48H82O18）計，不得少于0.80 mg；阿托伐他汀，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批準文號：國藥準字H19990258。

1.3.3 分組與造模 隨機分正常組、模型組、欣舒注射液組（簡稱中藥組）、阿托伐他汀組（簡稱西藥組），每組12只。除正常組外，其余3組行手術(shù)造模。用20%烏拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉家兔，于右側(cè)腹股溝部進行脫毛消毒。切開皮膚，分離右股動脈，穿刺右股動脈，逆行導入直徑2.5或3.0 mm的球囊導管（依血管直徑而定）至腎動脈下方，鹽水充盈球囊（壓力為4～6 atm），緩慢回拉導管至切口處，抽空球囊內(nèi)液體，使壓力降至零，重復上述過程，反復3次，達到剝脫動脈內(nèi)皮的目的。然后撤出導管，結(jié)扎股動脈，縫合皮膚。

1.3.4 給藥方法 正常組動物未經(jīng)手術(shù)及用藥；模型組術(shù)前、術(shù)后未用藥；中藥組動物于術(shù)前1 d開始給予欣舒注射液［4 mL/（kg·d）］，耳緣靜脈緩慢注射，連續(xù)用藥15 d；西藥組動物于術(shù)前1 d開始給予阿托伐他汀片［ mg/（kg·d）］口服，連續(xù)用藥 15 d。

1.3.5 標本采集與檢測 造模2周，正常組動物、中藥組動物、西藥組動物腹腔麻醉后，腹主動脈取血，分離血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時于37℃下溶化后，過0.22 μm濾膜過濾除菌。

2 方 法

2.1 原代平滑肌細胞培養(yǎng)

2.1.1 貼壁組織塊培養(yǎng) 實驗動物采用（細胞培養(yǎng)）氣栓法處死，放在5‰新潔爾滅托盤中，固定在木板上。移入超凈臺內(nèi)，剪開皮膚，腹膜右移內(nèi)臟，露出胸腹主動脈，自心臟的主動脈弓下至腎臟處剪斷。放入裝有試劑3的無菌平皿中清洗2次，除去外膜，清洗摘凈。移入試劑1的無菌平皿中剪成小塊。吸管吸出，放細胞培養(yǎng)瓶中，將細胞分散粘貼在一次性培養(yǎng)瓶壁上，倒放，下面加入5～6 mL試劑1，輕輕放入CO2溫箱內(nèi)。1 h后培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)靜置培養(yǎng)。2～3 d后觀察。

2.1.2 傳代細胞培養(yǎng) 細胞接種3 d后，貼壁的細胞呈放射形伸展，部分區(qū)域已融合生長，培養(yǎng)基的pH偏酸，需立即換新鮮培養(yǎng)基，以去掉沒有貼壁的細胞及破碎的細胞。6～7 d后，細胞長成單層和多層交錯的致密細胞層，即可傳代。傳代時，傾去原有液體，加試劑3清洗細胞面，然后傾去清洗液，再加試劑4浸泡30 s至1 min，當鏡下可觀察到細胞成片地收縮時，立即傾去消化液，加入試劑2，用彎頭滴管將細胞自瓶壁上吹打下來，以1∶2分裝接種。5 d后可再傳代。

2.2 血管平滑肌細胞的鑒定 血管平滑肌肌動蛋白（α-SMactin）免疫組織化學鑒定：α-SMactin一抗購自武漢博士德試劑公司。采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）法，檢測VSMC的 α-SMactin，以VSMC胞漿棕黃色為陽性結(jié)果。

2.3 平滑肌細胞增殖抑制實驗

2.3.1 MTT比色法 取傳至3代的細胞，用試劑4消化后，以試劑2將細胞稀釋至3×104／mL，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察待細胞長成次融合狀態(tài)后，隨后將2塊96孔板分為A.中藥血清組、B.西藥血清組，A、B兩組均設(shè)空白對照組、平滑肌細胞組，平滑肌細胞+正常兔血清組，中藥血清和西藥血清分別用試劑 2 按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512 比例稀釋，每組 8 個復孔，每孔液體總體積為100 μL，將96孔板于5%CO2、37℃下培養(yǎng) 24 h。以 PBS溶解 MTT制成 5 mg／mL溶液，20 μL／孔。細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，并于平板振蕩機上振蕩10 min，使深藍色結(jié)晶徹底溶解。用酶標測試儀在570 nm為檢測波長，630 nm為參考波長處檢測吸光度值（OD值）。

2.3.2 流式細胞儀檢測細胞生長周期 取3代生長狀況良好的VSMC，用試劑4消化后，以試劑2將細胞稀釋至3×104／mL，將細胞接種于3塊6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24～48 h，倒置顯微鏡下觀察待細胞長成次融合狀態(tài)時，以試劑2繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將3塊6孔培養(yǎng)板分為正常兔血清組（簡稱正常組）、25%中藥血清組（簡稱中藥組）、25%西藥血清組（簡稱西藥組），每組1塊培養(yǎng)板，每組6個復孔，每孔液體總體積為3 mL，分別培養(yǎng)24 h后，收集細胞，流式細胞儀測定細胞DNA含量，觀察細胞周期變化情況。

2.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。均數(shù)間經(jīng)方差齊性檢驗后，數(shù)值以（）表示，以單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果。

3 結(jié) 果

3.1 血管平滑肌細胞的鑒定 顯微鏡下觀察可見細胞的胞漿呈棕黃色，并且含有與細胞縱軸平行排列的肌絲。

3.2 MTT比色法測定 欣舒注射液對VSMC增殖的影響以細胞+25%藥物血清組對平滑肌細胞增殖的抑制最強，因此，采用25%濃度藥物血清進行流式細胞檢測。

3.3 流式結(jié)果 中藥組和西藥組G0/G1期細胞數(shù)目的百分比高于正常組（P<0.05）；中藥組S期、G2/M期細胞數(shù)目的百分比低于正常組 （P<0.05）；西藥組G2/M期細胞數(shù)目的百分比低于正常組 （P<0.05）。中藥組G2/M期細胞數(shù)目的百分比高于西藥組（P<0.05）。

4 討 論

血管成形術(shù)后24～72 h血管平滑肌細胞即開始增殖，7～14 d后達最高峰，約可持續(xù)1～2個月。在增生的內(nèi)膜中，血管平滑肌細胞約占總細胞的88.8%，依其增殖發(fā)生過程可將增殖期分為以下4個階段：中膜平滑肌細胞的增殖，平滑肌細胞內(nèi)膜下遷移和增殖，相對平衡期，再增殖期。這種再度增殖一般發(fā)生在PTCA術(shù)1個月以后，2～3個月達高峰，并可持續(xù)6個月至1年，直至發(fā)生再狹窄。這是PTCA術(shù)后最危險的時期［1］。

表1 各組兔平滑肌細胞增殖比較（）

表1 各組兔平滑肌細胞增殖比較（）

與細胞組比較，*P＜0.05；與細胞+正常兔血清組比較，△P＜0.05；與細胞+25%藥物血清比較，#P＜0.05。

表2 各組兔平滑肌細胞細胞周期比較（%，）

表2 各組兔平滑肌細胞細胞周期比較（%，）

與正常組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

MTT比色法的基本原理是活細胞的腺粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍紫色的甲肟。甲肟形成量與活細胞數(shù)及功能狀態(tài)呈正相關(guān)性。因此，可定量測定細胞的存活比例，進而反映藥物等因素作用后細胞增殖、存活的情況。

VSMC增殖信號轉(zhuǎn)導最終共同通路是細胞周期。G0/G1是細胞有絲分裂完成到DNA復制前的間期（G1期）與靜止（G0期）；S是細胞DNA復制期；G2/M是細胞處于DNA復制完成到有絲分裂開始間期（G2期）和有絲分裂期（M期）。其中有兩個主要調(diào)控點，G1-S轉(zhuǎn)折點和G2-M轉(zhuǎn)折點，G1-S轉(zhuǎn)折點控制細胞從DNA合成前期（G1期）進入DNA合成期（S期），G2-M轉(zhuǎn)折點為細胞一分為二的控制點。G1-S轉(zhuǎn)折點更為重要，是細胞中很多調(diào)節(jié)因子及細胞外刺激作用的位點。細胞周期是控制細胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過對細胞周期的調(diào)控，使細胞停滯于G0/G1期來阻斷VSMC的增殖可能是防治PCI術(shù)后再狹窄的一個有效的途徑。

中藥欣舒注射液是在益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)治療原則指導下組成的中藥復方制劑，由人參、麥冬、川芎組成，方中人參大補元氣、補脾益肺、生津、安神，麥冬養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩，川芎活血行氣、祛風止痛。藥理研究表明人參對心臟功能的影響主要是增加心肌收縮力，減慢心率，增加心輸出量和冠脈血流量，人參對心肌有保護作用［2］。麥冬注射液給急性實驗性心肌缺血犬靜脈注射，有改善心臟血流動力學的作用；對實驗性心肌梗死犬，有促進心肌損傷愈合和縮小梗死范圍及壞死區(qū)域的作用［2］。川芎嗪對血管內(nèi)皮細胞有保護作用，可抑制血管平滑肌細胞增殖［3］，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰﹑活血通絡(luò)之功。益氣養(yǎng)陰以鼓動血行，促使血流通暢，氣血調(diào)和，瘀血行散而氣機通暢，標實為血瘀，當活血通絡(luò)。

本實驗提示中藥欣舒注射液可能通過調(diào)控細胞周期G1-S、G2-M轉(zhuǎn)折點，進而抑制VSMC的增殖。

［1］高煒，霍勇，朱國英，等.再狹窄的細胞和分子生物學［J］.中國介入心臟病學雜志，1997，5（2）：85-89.

［2］馬清鈞，王淑玲.臨床實用中藥學［M］.江西：江西科學技術(shù)出版社，2002：120.

［3］田代華.實用中藥辭典［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：9.