楊 鶯 吳鳳蘭

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.解放軍96101部隊(duì)機(jī)關(guān)衛(wèi)生所，遼寧 沈陽(yáng) 110033）

近年來(lái)，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（PCI）已成為治療冠心病的主要手段之一，但術(shù)后再狹窄（RS）已成為影響冠心病徹底治療和PCI后長(zhǎng)期效果的主要障礙。VSMC增殖是PCI術(shù)后RS形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VSMC增殖是PCI術(shù)后新生內(nèi)膜的主要組成成分，是導(dǎo)致PCI術(shù)后RS形成機(jī)制的主要病因之一。本實(shí)驗(yàn)探討中藥欣舒注射液對(duì)VSMC增殖、細(xì)胞周期的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大耳白兔，4周齡，雄性，體質(zhì)量0.5 kg，購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。作細(xì)胞培養(yǎng)用。

1.2 試劑 試劑1：20%FBS（FBS購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆?，DMEM，高糖，雙抗，Hepes，NaHCO3。試劑 2：10%FBS，DMEM，高糖，雙抗，Hepes，NaHCO3。試 劑 3：0.01 mol，pH 7.4，PBS 配 制 ：NaCL 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g， 用雙蒸水依次溶解、添加，最后使總量為1000 mL，pH為7.4，高壓，4℃保存。試劑4：消化液配制：用PBS配制，4℃過(guò)夜，溶解。Tripsin（胰酶）：0.25/100 mL，EDTA 0.04/100 mL。

1.3 含藥血清制備

1.3.1 動(dòng)物 健康新西蘭大耳白兔48只，月齡6～8個(gè)月，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。作藥物血清制備用。

1.3.2 藥物 中藥欣舒注射液，由人參、麥冬、川芎組成，每 1 mL含總皂苷以人參皂苷Re（C48H82O18）計(jì)，不得少于0.80 mg；阿托伐他汀，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19990258。

1.3.3 分組與造模 隨機(jī)分正常組、模型組、欣舒注射液組（簡(jiǎn)稱(chēng)中藥組）、阿托伐他汀組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥組），每組12只。除正常組外，其余3組行手術(shù)造模。用20%烏拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉家兔，于右側(cè)腹股溝部進(jìn)行脫毛消毒。切開(kāi)皮膚，分離右股動(dòng)脈，穿刺右股動(dòng)脈，逆行導(dǎo)入直徑2.5或3.0 mm的球囊導(dǎo)管（依血管直徑而定）至腎動(dòng)脈下方，鹽水充盈球囊（壓力為4～6 atm），緩慢回拉導(dǎo)管至切口處，抽空球囊內(nèi)液體，使壓力降至零，重復(fù)上述過(guò)程，反復(fù)3次，達(dá)到剝脫動(dòng)脈內(nèi)皮的目的。然后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎股動(dòng)脈，縫合皮膚。

1.3.4 給藥方法 正常組動(dòng)物未經(jīng)手術(shù)及用藥；模型組術(shù)前、術(shù)后未用藥；中藥組動(dòng)物于術(shù)前1 d開(kāi)始給予欣舒注射液［4 mL/（kg·d）］，耳緣靜脈緩慢注射，連續(xù)用藥15 d；西藥組動(dòng)物于術(shù)前1 d開(kāi)始給予阿托伐他汀片［ mg/（kg·d）］口服，連續(xù)用藥 15 d。

1.3.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 造模2周，正常組動(dòng)物、中藥組動(dòng)物、西藥組動(dòng)物腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)于37℃下溶化后，過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

2 方 法

2.1 原代平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 貼壁組織塊培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用（細(xì)胞培養(yǎng)）氣栓法處死，放在5‰新潔爾滅托盤(pán)中，固定在木板上。移入超凈臺(tái)內(nèi)，剪開(kāi)皮膚，腹膜右移內(nèi)臟，露出胸腹主動(dòng)脈，自心臟的主動(dòng)脈弓下至腎臟處剪斷。放入裝有試劑3的無(wú)菌平皿中清洗2次，除去外膜，清洗摘凈。移入試劑1的無(wú)菌平皿中剪成小塊。吸管吸出，放細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞分散粘貼在一次性培養(yǎng)瓶壁上，倒放，下面加入5～6 mL試劑1，輕輕放入CO2溫箱內(nèi)。1 h后培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)靜置培養(yǎng)。2～3 d后觀察。

2.1.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種3 d后，貼壁的細(xì)胞呈放射形伸展，部分區(qū)域已融合生長(zhǎng)，培養(yǎng)基的pH偏酸，需立即換新鮮培養(yǎng)基，以去掉沒(méi)有貼壁的細(xì)胞及破碎的細(xì)胞。6～7 d后，細(xì)胞長(zhǎng)成單層和多層交錯(cuò)的致密細(xì)胞層，即可傳代。傳代時(shí)，傾去原有液體，加試劑3清洗細(xì)胞面，然后傾去清洗液，再加試劑4浸泡30 s至1 min，當(dāng)鏡下可觀察到細(xì)胞成片地收縮時(shí)，立即傾去消化液，加入試劑2，用彎頭滴管將細(xì)胞自瓶壁上吹打下來(lái)，以1∶2分裝接種。5 d后可再傳代。

2.2 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定 血管平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMactin）免疫組織化學(xué)鑒定：α-SMactin一抗購(gòu)自武漢博士德試劑公司。采用鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）法，檢測(cè)VSMC的 α-SMactin，以VSMC胞漿棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。

2.3 平滑肌細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

2.3.1 MTT比色法 取傳至3代的細(xì)胞，用試劑4消化后，以試劑2將細(xì)胞稀釋至3×104／mL，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞長(zhǎng)成次融合狀態(tài)后，隨后將2塊96孔板分為A.中藥血清組、B.西藥血清組，A、B兩組均設(shè)空白對(duì)照組、平滑肌細(xì)胞組，平滑肌細(xì)胞+正常兔血清組，中藥血清和西藥血清分別用試劑 2 按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512 比例稀釋?zhuān)拷M 8 個(gè)復(fù)孔，每孔液體總體積為100 μL，將96孔板于5%CO2、37℃下培養(yǎng) 24 h。以 PBS溶解 MTT制成 5 mg／mL溶液，20 μL／孔。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，并于平板振蕩機(jī)上振蕩10 min，使深藍(lán)色結(jié)晶徹底溶解。用酶標(biāo)測(cè)試儀在570 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值（OD值）。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期 取3代生長(zhǎng)狀況良好的VSMC，用試劑4消化后，以試劑2將細(xì)胞稀釋至3×104／mL，將細(xì)胞接種于3塊6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24～48 h，倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞長(zhǎng)成次融合狀態(tài)時(shí)，以試劑2繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將3塊6孔培養(yǎng)板分為正常兔血清組（簡(jiǎn)稱(chēng)正常組）、25%中藥血清組（簡(jiǎn)稱(chēng)中藥組）、25%西藥血清組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥組），每組1塊培養(yǎng)板，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔液體總體積為3 mL，分別培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞DNA含量，觀察細(xì)胞周期變化情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。均數(shù)間經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，數(shù)值以（）表示，以單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

3 結(jié) 果

3.1 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定 顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞的胞漿呈棕黃色，并且含有與細(xì)胞縱軸平行排列的肌絲。

3.2 MTT比色法測(cè)定 欣舒注射液對(duì)VSMC增殖的影響以細(xì)胞+25%藥物血清組對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的抑制最強(qiáng)，因此，采用25%濃度藥物血清進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

3.3 流式結(jié)果 中藥組和西藥組G0/G1期細(xì)胞數(shù)目的百分比高于正常組（P<0.05）；中藥組S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)目的百分比低于正常組 （P<0.05）；西藥組G2/M期細(xì)胞數(shù)目的百分比低于正常組 （P<0.05）。中藥組G2/M期細(xì)胞數(shù)目的百分比高于西藥組（P<0.05）。

4 討 論

血管成形術(shù)后24～72 h血管平滑肌細(xì)胞即開(kāi)始增殖，7～14 d后達(dá)最高峰，約可持續(xù)1～2個(gè)月。在增生的內(nèi)膜中，血管平滑肌細(xì)胞約占總細(xì)胞的88.8%，依其增殖發(fā)生過(guò)程可將增殖期分為以下4個(gè)階段：中膜平滑肌細(xì)胞的增殖，平滑肌細(xì)胞內(nèi)膜下遷移和增殖，相對(duì)平衡期，再增殖期。這種再度增殖一般發(fā)生在PTCA術(shù)1個(gè)月以后，2～3個(gè)月達(dá)高峰，并可持續(xù)6個(gè)月至1年，直至發(fā)生再狹窄。這是PTCA術(shù)后最危險(xiǎn)的時(shí)期［1］。

表1 各組兔平滑肌細(xì)胞增殖比較（）

表1 各組兔平滑肌細(xì)胞增殖比較（）

與細(xì)胞組比較，*P＜0.05；與細(xì)胞+正常兔血清組比較，△P＜0.05；與細(xì)胞+25%藥物血清比較，#P＜0.05。

表2 各組兔平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期比較（%，）

表2 各組兔平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期比較（%，）

與正常組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

MTT比色法的基本原理是活細(xì)胞的腺粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍(lán)紫色的甲肟。甲肟形成量與活細(xì)胞數(shù)及功能狀態(tài)呈正相關(guān)性。因此，可定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例，進(jìn)而反映藥物等因素作用后細(xì)胞增殖、存活的情況。

VSMC增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終共同通路是細(xì)胞周期。G0/G1是細(xì)胞有絲分裂完成到DNA復(fù)制前的間期（G1期）與靜止（G0期）；S是細(xì)胞DNA復(fù)制期；G2/M是細(xì)胞處于DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始間期（G2期）和有絲分裂期（M期）。其中有兩個(gè)主要調(diào)控點(diǎn)，G1-S轉(zhuǎn)折點(diǎn)和G2-M轉(zhuǎn)折點(diǎn)，G1-S轉(zhuǎn)折點(diǎn)控制細(xì)胞從DNA合成前期（G1期）進(jìn)入DNA合成期（S期），G2-M轉(zhuǎn)折點(diǎn)為細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)。G1-S轉(zhuǎn)折點(diǎn)更為重要，是細(xì)胞中很多調(diào)節(jié)因子及細(xì)胞外刺激作用的位點(diǎn)。細(xì)胞周期是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，使細(xì)胞停滯于G0/G1期來(lái)阻斷VSMC的增殖可能是防治PCI術(shù)后再狹窄的一個(gè)有效的途徑。

中藥欣舒注射液是在益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)治療原則指導(dǎo)下組成的中藥復(fù)方制劑，由人參、麥冬、川芎組成，方中人參大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津、安神，麥冬養(yǎng)陰潤(rùn)肺、益胃生津、清心除煩，川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛。藥理研究表明人參對(duì)心臟功能的影響主要是增加心肌收縮力，減慢心率，增加心輸出量和冠脈血流量，人參對(duì)心肌有保護(hù)作用［2］。麥冬注射液給急性實(shí)驗(yàn)性心肌缺血犬靜脈注射，有改善心臟血流動(dòng)力學(xué)的作用；對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌梗死犬，有促進(jìn)心肌損傷愈合和縮小梗死范圍及壞死區(qū)域的作用［2］。川芎嗪對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖［3］，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰﹑活血通絡(luò)之功。益氣養(yǎng)陰以鼓動(dòng)血行，促使血流通暢，氣血調(diào)和，瘀血行散而氣機(jī)通暢，標(biāo)實(shí)為血瘀，當(dāng)活血通絡(luò)。

本實(shí)驗(yàn)提示中藥欣舒注射液可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期G1-S、G2-M轉(zhuǎn)折點(diǎn)，進(jìn)而抑制VSMC的增殖。

［1］高煒，霍勇，朱國(guó)英，等.再狹窄的細(xì)胞和分子生物學(xué)［J］.中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，1997，5（2）：85-89.

［2］馬清鈞，王淑玲.臨床實(shí)用中藥學(xué)［M］.江西：江西科學(xué)技術(shù)出版社，2002：120.

［3］田代華.實(shí)用中藥辭典［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：9.