張淑芹 陶 紅 劉翠文

（1.河北省秦皇島市中醫(yī)院，河北 秦皇島 066000；2.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院，河北 唐山 064000）

急性心肌梗死屬中醫(yī)學“胸痹”“、真心痛”等病證，筆者認為其基本病機特點為正氣虧虛、毒瘀阻絡。臨床大量報道四妙勇安湯及失笑散治療急性心肌梗死療效顯著［1-4］。本實驗就四妙勇安湯合失笑散對內皮細胞生長因子表達的影響展開研究，以探討其治療急性心肌梗死的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性健康Wistar大鼠60只，體質量180～220 g，清潔級。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號為CXX（京）2007-0001。

1.2 藥物與試劑 四妙勇安湯合失笑散（由當歸30 g，金銀花 30 g，玄參 20 g，甘草 15 g，蒲黃 6 g，五靈脂 6 g，濃縮成2 g/mL的生藥煎劑）：由本院中藥制劑室提供。

1.3 儀器與試劑 TRIZOL Reagent（Invitrogen）；R Tmaster Mix，Taq DNA polymerase，引物及探針由大連寶生物公司提供。見表1。標準品質粒由上?；瞪锟萍加邢薰咎峁４笫骎EGF Elisa試劑盒，由武漢博士德生物科技有限公司提供，批號：EK0540。slan熒光定量PCR儀（上海宏石）。Bio-mini分光光度計（日本島津）。550型酶標儀（美國伯樂）。

1.4 模型制備 建立大鼠急性心肌梗死模型。大鼠麻醉后仰位固定，從胸骨左側第3、4肋間正中線旁開5 mm行縱向切口，將心臟輕輕擠出，于左心耳根部下方2～3 mm處穿線，結扎冠狀動脈左前降支，建立心肌缺血模型。結扎后迅速將心臟還納，關閉胸腔，恢復自主呼吸。手術前后記錄心電圖，以術后Ⅱ導聯(lián)心電圖ST段弓背向上抬高為模型復制成功的標志。術后連續(xù)3 d注射青霉素80萬U／d以預防感染。假手術組只開胸穿線，不結扎冠脈，其余操作同上。

1.5 分組及給藥 60只SD大鼠隨機分為5組：四妙勇安湯合失笑散大、中、小劑量組、假手術組、模型組各12只。四妙勇安湯合失笑散大、中、小劑量組和模型組于手術前 6 d 開始灌胃，劑量分別為 28、14、7 g/（kg·d），第6日進行造模，對照組于相同時間給予滅菌蒸餾水2 mL灌胃。每日 2次，分別再灌胃 10 d［5］。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 實時熒光定量PCR檢測VEGF mRNA的表達水平 取心肌組織組織，用Trizol法提取總RNA，檢測RNA純度及濃度。取純度好的樣品進行逆轉錄反應，10 μL反應體系，cDNA置-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應體系為 25 μL：Taq 酶 12.5 μL，10 μΜ 上、 下游引物各0.5 μL，3 μΜ 熒光探針 1 μL， 模板 （cDNA）2 μL，補DEPC水至25 μL。反應條件為95℃預變性60 s，95℃10 s、6℃ 30 s擴增40個循環(huán)，在60℃讀取熒光。每個樣品設3個平行復孔取均值。用內參進行標準化處理后進行相對定量分析。

表1 引物及探針序列

1.6.2 ELISA法測定 耳中央動脈血清VEGF濃度。

2 結 果

2.1 大鼠心肌VEGF mRNA表達變化 見表2。結果表明，模型組VEGF mRNA表達水平較假手術組有升高（P＜0.05），其他各組較假手術組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，四妙勇安湯合失笑散大、中劑量組VEGF mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01），小劑量組略有升高（P＞0.05）。

2.2 各組血清VEGF濃度變化 見表3。研究表明，模型組血清VEGF含量較假手術組有升高（P＜0.05），其他各組較假手術組顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比較，四妙勇安湯合失笑散大、中劑量組VEGF含量顯著升高（P＜0.01），四妙勇安湯合失笑散小劑量組略有升高（P＞0.05）。

表2 各組大鼠心肌VEGF mRNA表達比較（）

表2 各組大鼠心肌VEGF mRNA表達比較（）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

表3 各組大鼠血清VEGF蛋白濃度比較（）

表3 各組大鼠血清VEGF蛋白濃度比較（）

3 討 論

急性冠狀動脈綜合征是指急性心肌缺血引起的一組臨床癥狀，包括ST段抬高心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，已成為臨床常見的嚴重心血管疾病。其主要發(fā)病機制是在破裂的動脈粥樣硬化斑塊基礎上形成血栓，進而完全或不完全堵塞冠狀動脈，造成心肌急性缺血。

血管內皮細胞生長因子（VEGF）是一種特異作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，屬于血小板源生長因子家族成員，是促血管生成的主要因素之一。VEGF及其受體在血管新生中起著最關鍵的作用，調控著內皮細胞的增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)［6］。血清低水平的VEGF會造成急性心肌?；颊甙l(fā)生多種并發(fā)癥的危險［7］。

四妙勇安湯具有滋陰養(yǎng)血，清毒祛瘀的功效。綠原酸和阿魏酸分別為金銀花和當歸的主要有效成分，具有心血管保護作用。失笑散屬理血劑，由五靈脂和蒲黃兩味藥組成，具活血化瘀，散結止痛之功效，主治瘀血停滯。研究資料表明，活血化瘀中藥可擴張血管口徑，增加血流量，改善微循環(huán)和血液流變學，降低微血管內血細胞的聚集，延長凝血及血栓形成時間的作用。該類藥物還可以促進VEGF及其他多種細胞因子表達［8-9］。

本實驗結果提示：四妙勇安湯合失笑散可增高血清中VEGF含量；同時可上調心肌VEGF mRNA的表達，其中大劑量組的作用最好。所以四妙勇安湯合失笑散治療心肌梗死的機制有可能是通過促進心肌梗死大鼠心肌VEGF的表達、分泌，從而促進梗死心肌血管新生。

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［6］Carrato A，Gallego-Plazas J，et al.Anti-VEGF therapy：a new approach to colorectal cancer therapy［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2006，6（10）：1385-1396.

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