劉續(xù)芳 張秀蘭 李占海

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

金蓮花片蒙名為阿拉騰花片，為金蓮花單方制劑，是蒙醫(yī)常用藥，其主要有效成分為黃酮類化合物［1］，具有抗菌和抗病毒作用［2］，因含有抗菌成分，就可能影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性。所以在做微生物限度檢查時(shí)，必須進(jìn)行方法驗(yàn)證，以確認(rèn)測定方法的可靠性。通過對金蓮花片的微生物限度檢查按2010版藥典［3］的規(guī)定進(jìn)行了方法驗(yàn)證，確立了該品種微生物限度檢查方法。

1 材料

1.1 儀器:HTY—2000集菌儀、YJ—43—4000電動(dòng)離心沉淀機(jī)、反復(fù)使用集菌培養(yǎng)器。

1.2 試劑:稀釋劑:pH0.7氯化鈉—蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基等由中國生物制品檢定所提供。

1.3 試驗(yàn)菌珠:大腸埃希菌CMCC(B)44102，金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003，枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501，黑曲霉菌CMCC(F)98003，白色念珠菌CMCC(F)98001。以上5種菌由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 供試品:金蓮花片(承德天原藥業(yè)有限公司生產(chǎn) 批號(hào):110646)。

2 方法

2.1 細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.1.1 菌液制備:接種大腸埃希菌、金黃色萄葡球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100CFU的菌懸液。做活菌記數(shù)備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中。23～28℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每 1mL含 50～100CFU的菌懸液。做活菌記數(shù)備用。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7d，使大量的孢子產(chǎn)生，加入3～5mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi)，將菌液稀釋至每1mL含50～100CFU的菌懸液。做活菌記數(shù)備用。

2.1.2 供試液制備:取供試品10g，加稀釋劑100mL制成1:10的供試液備用。

2.1.3 試驗(yàn)方法 常規(guī)法:采用加1mL·皿－1的供試液，加入15～20ml瓊脂培養(yǎng)基做菌落記數(shù)。培養(yǎng)基稀釋法:采用加0.2mL/皿－1的供試液，加入15～20mL瓊脂培養(yǎng)基做菌落記數(shù)。離心薄膜過濾法:取1:10的供試液10mL移至滅菌的離心管中以500轉(zhuǎn)/min離心10min后，取上清液1mL加入置有沖洗液的反復(fù)使用的薄膜濾器中，沖洗液300mL/膜，分3次沖洗。在最后的沖洗液中加入1mL菌液(50～100CFU·mL－1)濾干，然后取膜貼于瓊脂板，置適宜的溫度培養(yǎng)48～72d觀察結(jié)果。

2.1.4 回收率測定 試驗(yàn)組:取1:10的供試液各1mL，加入50～100CFU的試驗(yàn)菌，立即注入45℃相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，搖勻，凝固后，將平板倒置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)值規(guī)定的時(shí)間，計(jì)數(shù)其菌落數(shù)。菌液組:取試驗(yàn)菌液1ml，分別放人2個(gè)平皿，同上述方法計(jì)數(shù)所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對照組:取規(guī)定量的供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

回收率計(jì)算:試驗(yàn)組的菌回收率(%)=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù))×100%

2.1.5 結(jié)果:常規(guī)法測定金蓮花片試驗(yàn)數(shù)據(jù)及回收率見表1。

表1 金蓮花片常規(guī)法

從表l的結(jié)果可以看出:金蓮花片對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均低于70%，說明該藥有抑細(xì)菌作用。而對黑曲霉菌、白色念珠菌的回收率均高于70%，說明無抑霉菌作用。

培養(yǎng)基稀釋法:用培養(yǎng)基稀釋法測定上述含抑菌成分的蒙藥微生度的驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)及回收率見表2。

表2 金蓮花片稀釋法

從表2可以看出，金蓮花片對枯草芽孢桿菌的回收率低于70%，說明有抑菌作用，培養(yǎng)基稀釋法不能消除該藥的抑菌作用。

離心集菌薄膜過濾法:用離心集菌薄膜過濾法測定上述含抑菌成分蒙藥微生物限度的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 金蓮花片離心集菌薄膜過濾法

從表3可見回收率高于70%，表明離心集菌薄膜過濾法可用于該藥的細(xì)菌數(shù)檢查。

2.2 控制菌檢查方法驗(yàn)證

2.2.1 大腸埃希菌的驗(yàn)證 菌液制備:同前菌液的制備，制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌液。

驗(yàn)證方法:試驗(yàn)組:取1:10供試液10mL及10～100CFU大腸埃希菌注入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。陰性菌對照組:取1:10供試液10mL及10～100CFU金黃色葡萄球菌注入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。

2.2.2 大腸菌群的驗(yàn)證菌液制備:同前菌液的制備，制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌液。

驗(yàn)證方法:試驗(yàn)組:取1:10供試液1mL、1:100供試液1mL、1:1000供試液1mL分別加入10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支中，同時(shí)分別加入10～100CFU大腸埃希菌，依大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。陰性菌對照組:取1:10供試液1mL、1:100供試液1mL、1:1000供試液 1mL分別加入10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支中，同時(shí)分別加入10～100CFU金黃色葡萄球菌，依大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。

2.2.3 試驗(yàn)結(jié)果:大腸埃希菌、大腸菌群檢查方法驗(yàn)證結(jié)果見表4。

表4 常規(guī)法控制菌驗(yàn)證結(jié)果

2.2.4 結(jié)果判斷:從表4可以看出，用常規(guī)法即可檢查出大腸埃希菌、大腸菌群。

3 討論

通過對本品細(xì)菌數(shù)、霉菌檢查驗(yàn)證，確定該品種采用薄膜過濾法測定其細(xì)菌數(shù)，采用藥典常規(guī)法可測定其霉菌數(shù)，采用藥典常規(guī)法檢查其控制菌。參考文獻(xiàn)

［1］黃睿，張貴君，潘艷麗等.金蓮花化學(xué)成分的HPLC－MS表征分析與鑒定〔J〕.中草藥雜志，2012，43(4:)670－672

［2］楊宏昕，常亮，趙陽等.蒙藥金蓮花藥理作用研究〔J〕.中國藥業(yè)雜志2012，21(20):29－30

［3］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典〔S〕.二部.2010，107－111