李巧英

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，山西 太原 030006）

玉米是我國的第一大糧食作物，每年全國種植面積達(dá)3 333.3萬hm2，需種量約11億kg，龐大的市場份額吸引了眾多的國內(nèi)外種子企業(yè)進(jìn)軍玉米種子市場。市場上銷售的玉米種子的品種越來越多，假冒侵權(quán)案件頻發(fā)，市場監(jiān)管難度進(jìn)一步加大，用原來的蛋白檢測方法已不能將現(xiàn)有的品種完全區(qū)分開來，而田間鑒定又受自然條件和品種表現(xiàn)性狀的限制，鑒定周期較長。近年來，隨著分子標(biāo)記方法研究的發(fā)展，SSR分子標(biāo)記方法檢測玉米種子真實(shí)性已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。但是在實(shí)際應(yīng)用過程中，也存在許多問題，值得大家思考。下面就SSR分子標(biāo)記方法檢測玉米種子真實(shí)性試驗(yàn)中遇到的問題進(jìn)行一些探討。

1 檢測樣品的純度問題

檢測樣品的純度直接影響真實(shí)性檢測結(jié)果的判定。如果檢測樣品采取混樣提取DNA，由于檢測樣品純度較低，檢測后會出現(xiàn)單雙帶和雙帶、三帶的現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜帶不同，鑒定困難。遇到這種情況，我們需要進(jìn)行樣品提純，一是將樣品進(jìn)行單粒提取DNA，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較（如圖1）后，剔除雜粒，再與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，獲得該樣品的譜帶類型，這種方法工作量較大；二是先做樣品的蛋白質(zhì)電泳，確定樣品的純度值，達(dá)到一定要求后再進(jìn)行真實(shí)性檢測，這樣可以大大減少工作量，方法比較簡單。

（如上圖：檢測樣品出現(xiàn)3種帶型，雙帶：1；雙帶：3、5；單帶：2、4。標(biāo)準(zhǔn)樣品為雙帶，帶型一致，與 3、5 號檢測樣品的帶型一致，表明檢測樣品不純，將1、2、4號樣品剔除后繼續(xù)做其他引物。）

（上圖中，檢測樣品1—5帶型一致，均為單帶。標(biāo)準(zhǔn)樣品6—10出現(xiàn)兩種帶型，6、8為單帶，與檢測樣品帶型一致，7、9、10為雙帶，比檢測樣品多1條較小的帶，無法確定標(biāo)準(zhǔn)樣品的帶型。）

2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度問題

標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜帶是鑒定樣品的依據(jù)。如果標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜帶不一致，無法確定該樣品的真正譜帶類型，很容易造成錯誤判斷，導(dǎo)致結(jié)論偏差（如圖2）。因此，玉米種子真實(shí)性檢測中所使用的標(biāo)準(zhǔn)樣品必須滿足一定的要求，符合有關(guān)規(guī)定，且純度合格。

3 DNA提取方法的問題

現(xiàn)在各個實(shí)驗(yàn)室采用的DNA提取方法很多，有CTAB法、SDS法等常規(guī)的方法，有改良后的方法，還有簡化的方法。不管是用哪種方法，只要提取出來的DNA質(zhì)量能夠滿足做SSR分子標(biāo)記檢測就可以，而且試驗(yàn)操作簡單，方法容易掌握，使用藥品試劑少，對環(huán)境的污染也減少。一些方法經(jīng)過進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證后值得提倡。

4 混樣檢測和單粒檢測的問題

玉米種子真實(shí)性檢測可以混樣提取DNA，也可以進(jìn)行單粒檢測。單粒檢測工作量大，混樣檢測可以大大降低工作量。但是，如果樣品的純度比較低，混樣檢測后會出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)樣品不同的譜帶，還需要再進(jìn)行單粒檢測，以除去樣品中的雜粒。實(shí)際操作中，可以將混樣檢測和單粒檢測配合使用，對純度較高的樣品采取混樣檢測，純度不高的樣品宜采用單粒檢測，去掉混入樣品中的雜粒后再混樣檢測，以減少工作量。

5 引物檢測的問題

SSR分子標(biāo)記方法檢測玉米種子真實(shí)性，目前主要采用檢測40對引物，差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定檢測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致。但是，在實(shí)際操作中，如果一個檢測樣品經(jīng)檢測出現(xiàn)兩對引物譜帶類型與標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，是否還需要繼續(xù)檢測其他的引物；若檢測，再檢測多少對引物比較合適，這一問題還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

6 電泳方法的選擇

PCR產(chǎn)物檢測方法可以選擇小板膠電泳、大板序列膠電泳和毛細(xì)管電泳。3種方法比較，毛細(xì)管電泳檢測精確度高、操作簡單、省時省力，但是儀器本身、儀器維護(hù)、熒光引物、使用耗材等費(fèi)用較高；序列膠電泳檢測需要灌膠、電泳、染色、圖片保存等程序，費(fèi)時、費(fèi)力，雖然費(fèi)用較低，能夠滿足檢測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品之間的兩兩一致性比較，但是精確度較低，無法讀出精確的數(shù)據(jù)結(jié)果；小板膠電泳檢測灌膠、電泳、染色等程序相對簡單，但是精確度更低，有些距離較近的譜帶不能很好地分開。實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件具體考慮。

7 各個實(shí)驗(yàn)室間試驗(yàn)結(jié)果的對接

如果用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測，可以得出較精確的數(shù)據(jù)結(jié)果，但是不同型號的儀器，甚至是相同型號的儀器，在不同的實(shí)驗(yàn)室都會出現(xiàn)一定的偏差，需要進(jìn)行數(shù)據(jù)的矯正與整合，各個實(shí)驗(yàn)室間得出的檢測結(jié)果才具有可比性。如果用大板序列膠檢測，因?yàn)樵谛蛄心z上無法準(zhǔn)確地讀出檢測樣品的數(shù)據(jù)，只能看到它的相對位置，估測它的大小，要獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)結(jié)果，需要檢測樣品與一個參照值進(jìn)行比較得出它的精確數(shù)據(jù)，才能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的對接。