鄭笑為，汪 祺，劉 燕，于建東，戴 忠，魯 靜，林瑞超 （中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

生脈注射液為華西醫(yī)科大學藥學院根據(jù)我國古驗方 “生脈散”研制而成，由紅參、麥冬、五味子經(jīng)提取后制成的滅菌水溶液。該品種具有益氣養(yǎng)陰、復脈固脫的功效。現(xiàn)代藥理學研究證明其具有擴張血管與增進冠狀動脈血流量的作用，臨床上可用于治療心肌梗塞、心源性休克、感染性休克及其他微循環(huán)障礙［1］。目前全國共有8家企業(yè)生產(chǎn)，針對生脈注射液不同成分進行的研究曾有文獻報道［2－9］。為控制本品的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，本試驗樣品經(jīng)過C18柱和大孔樹脂處理比較后，經(jīng)過多次調(diào)整梯度洗脫程序，確立采用HPLC法對8個廠家的樣品進行了測定，建立了標準指紋圖譜，由23個特征峰組成。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型液相色譜儀。

1.2 試藥

對照品：人參皂苷 Rg1（批號：110703－201027）、Re （批號：110754－200822）、Rf（批號：111719－200703）、Rb1（批 號：110704－200921）、Rg2（批 號：111779－200801）、Rb2（批 號：111715－200802）、Rb3（批號：111686－201002），五味子醇甲（批號：110857－201010），原人參三醇（批 號：111755－200601），五味子甲素（批 號：110764－200609）（中國食品藥品檢定研究院）。被測樣品均由生脈注射液生產(chǎn)企業(yè)提供，批號見表1。乙腈為色譜純 （Merck公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相及洗脫程序見表2，流速：1.0 mL·min－1，檢測波長：203 nm，柱溫：30℃，進樣量：20μL。

表2 流動相及洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備

取人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rg2、Rb2、Rb3、Rd、原人參三醇對照品約5 mg，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對照品約2 mg，于10 m L量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品20 mL，通過AB－8大孔樹脂 （大孔樹脂10 g，直徑1.5 cm），用25%乙醇150 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用95%乙醇150 mL，洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得。

2.4 樣品測定

2.4.1 共有峰的確定

通過對多批樣品的測定，選擇穩(wěn)定性好、吸收強、特征明顯的色譜峰為共有峰，共標定23個峰。其中以現(xiàn)有對照品為參照標記了12個峰的歸屬。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 生脈注射液混合對照品色譜圖

2.4.2 8家企業(yè)指紋圖譜

隨機抽取8個企業(yè)各1批樣品生成對照圖譜，對選定的23個特征峰進行mark峰匹配，非共有峰面積均小于10%，結(jié)果見表3、圖3。

圖2 生脈注射液典型色譜圖

表3 企業(yè)指紋圖譜mark峰相似度結(jié)果

圖3 8家企業(yè)生產(chǎn)的生脈注射液指紋圖譜

3 討論

3.1 樣品前處理

3.1.1 經(jīng)C18小柱處理

取本品3 mL過C18小柱，分別用20 mL水洗，10%，25%，50%，75%，95%乙醇分段洗脫，收集洗脫液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解；另取本品3 mL過C18小柱，用95%乙醇洗脫，收集洗脫液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解；再取本品3 mL過C18小柱后直接進樣，結(jié)果見圖4。采用95%乙醇直接洗脫效果較好，指紋圖譜信息較多，但基線分離較差。

3.1.2 經(jīng)大孔樹脂處理

取本品20 m L，通過AB－8大孔樹脂 （大孔樹脂10 g，直徑1.5 cm），分別用150 m L水洗，10%，25%，50%，75%，95%乙醇分段洗脫，收集洗脫液蒸干，殘渣加甲醇2 m L使溶解；另取本品20 m L過大孔樹脂柱，用95%乙醇洗脫，收集洗脫液蒸干，殘渣加甲醇2 m L使溶解；再取本品直接進樣，結(jié)果見圖5。采用95%乙醇直接洗脫效果較好，指紋圖譜信息較多，且基線分離比較好。

比較經(jīng)過C18小柱和大孔樹脂柱處理的樣品指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)過大孔樹脂后，直接用95%乙醇洗脫效果更好，但在40～50 min附近與原液直接進樣相似，基線不平雜質(zhì)較多，采用20%和25%乙醇150 m L先除去一些雜質(zhì)，再用95%乙醇洗脫，結(jié)果見圖6。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)原標準提供的指紋圖譜液相條件，分離效果不好，集中在60 min后出峰，且100%的水或乙腈的比例會影響色譜柱的使用壽命。曾選用不同溶劑系統(tǒng)作為流動相進行試驗，乙腈－水、甲醇－水、乙腈－0.1%磷酸等溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈－水梯度洗脫效果最佳。

圖7為不同梯度條件的液相色譜圖。

3.3 檢測波長的選擇

《中國藥典》2010年版一部人參項下采用203 nm為檢測波長測定人參皂苷的含量。取本品測定，分別得到其在203，210，220，230和254 nm 5個波長下的色譜圖。隨著波長的增加，色譜峰數(shù)目減少且峰面積變小，在203 nm波長處色譜峰數(shù)目最多且峰面積最大，故最終確定檢測波長為203 nm。

本試驗方法已經(jīng)進行了方法學考察，方法可行［10－11］。

［1］夏晶，王鋼力，季申，等.HPLC測定生脈注射液中4種成分的含量 ［J］.中成藥，2006，28 （1）：27－30.

［2］陸娟，李緒文，魏巍，等.RP－HPLC測定生脈注射液中7個人參皂苷類成分的含量 ［J］.藥物分析雜志，2011，31（12）：2302－2304.

［3］白晶，張磊，于治國，等.RP－HPLC法同時測定生脈注射液中人參皂苷Rb1與五味子醇甲的含量 ［J］.藥物分析雜志，2006，12 （11）：1585－1587.

［4］曹樹萍，聶黎行，王鋼力.HPLC法同時測定參脈注射液中9個人參皂苷的含量 ［J］.藥物分析雜志，2011，31（3）：476－479.

［5］陳志清，徐柏頤.HPLC測定生脈注射液中人參皂苷Re的含量 ［J］.中國中藥雜志，1999，24 （1）：36－38.

［6］夏晶，王鋼力，季申，等.生脈注射液HPLC指紋圖譜的研究 ［J］.中成藥，2006，28 （8）：1093－1095.

［7］徐世霞.HLPC法測定生脈注射液中5－羥甲基糠醛的含量［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2011，14：36－39.

［8］楊柳，劉奕明，曾星，等.HPLC／MS／MS法測定參脈注射液及人血漿中的人參皂苷Rg1［J］.藥物分析雜志，2005，25 （8）：905－907.

［9］張萍，張南平，肖新月，等.人參皂苷類成分的化學研究［J］.藥物分析雜志，2004，24 （3）：229－231.

［10］鄭笑為，汪琪，于建東，等.生脈注射液HPLC指紋圖譜的建立 ［J］.藥物分析雜志，2012，32 （8）：1471－1475.

［11］汪琪，鄭笑為，于建東，等.生脈注射液超高效液相色譜指紋圖譜的建立及特征成分分析 ［J］.藥物分析雜志，2012，32 （10）：1813－1817.