蘇紅曉，檀華蓉，沈虎琴，田春秋

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽 合肥 230036)

球蟲(chóng)病是一種對(duì)家禽腸道有損害、分布很廣的寄生蟲(chóng)病，它不僅可以引起雞只死亡、發(fā)育停滯，還可導(dǎo)致產(chǎn)蛋減少、飼料報(bào)酬低，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害很大。目前球蟲(chóng)病的有效防治技術(shù)有藥物防治、生物免疫、日糧調(diào)控等，藥物防治是防治球蟲(chóng)病的主要手段［1－3］。而最常用的抗球蟲(chóng)藥物為三嗪類中的地克珠利(Diclazuril)和磺胺類中的磺胺(Sulfanilamide)、磺胺氯吡嗪(Sulfaclozine)、磺胺喹啉(Sulfaquinoxaline)，它們因高效、低毒、廣譜的驅(qū)蟲(chóng)特點(diǎn)而在我國(guó)得到廣泛應(yīng)用［3－6］。

此類抗球蟲(chóng)藥物進(jìn)入到生物體后大部分以原藥和代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動(dòng)物的糞便、尿液進(jìn)入土壤、表層水體等生態(tài)環(huán)境中，在環(huán)境中降解非常緩慢，殘留時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)長(zhǎng)期積累對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生毒害作用，影響其中的植物、動(dòng)物和微生物的正常生命活動(dòng)，甚至通過(guò)生物鏈的傳遞，在人體內(nèi)達(dá)到較高濃度，最終影響人體健康［7－9］。因此，此類抗生素作為一類重要的環(huán)境有機(jī)污染物應(yīng)引起各方面關(guān)注。

目前，雖然抗球蟲(chóng)類藥物的檢測(cè)方法已有相關(guān)報(bào)道［10－13］，但在環(huán)境中同時(shí)分析這兩類抗球蟲(chóng)藥物的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用毛細(xì)管電泳的高效、快速、運(yùn)行成本低等特點(diǎn)，建立了一種毛細(xì)管電泳方法，能夠同時(shí)檢測(cè)土壤中的上述4種抗球蟲(chóng)藥物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)，為開(kāi)展抗球蟲(chóng)藥環(huán)境行為研究及應(yīng)對(duì)措施的制定提供了一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的分析方法。

圖1 4種抗球蟲(chóng)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four anticoccidial drugs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀(P/ACETMMDQ，Beckman，USA)配有二極管陣列檢測(cè)器和色譜工作站;未涂層熔融石英毛細(xì)管(60 cm×75 μm，河北永年與銳灃色譜器件有限公司);Seven Multi pH計(jì)(S40，Metter Toledo，CH);Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(Millipore，USA);R系列－旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);調(diào)速多用振蕩器(上海智域分析儀器制造有限公司);H-1650臺(tái)式高速離心機(jī)(上海穗康儀器有限公司)。

磺胺(SA，純度 ＞99.8%)、磺胺氯吡嗪(SCP，純度 ＞99.8%)、磺胺喹啉(SQX，純度 ＞99.8%)、地克珠利(DIC，純度 ＞99.8%)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;硼砂、硼酸、四氫呋喃(THF)、KH2PO4、NaOH(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。樣品采自合肥周邊4個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)。樣品經(jīng)自然風(fēng)干、研碎后以60目篩篩分，儲(chǔ)存于廣口瓶中備用。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取SA、SQX、SCP、DIC標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，DIC用四氫呋喃溶解定容至10 mL，其它3種藥物用30 mmol/L NaOH溶液溶解定容至10 mL，分別配制成1.00 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液;上機(jī)前混合4種標(biāo)準(zhǔn)貯備液并用60%乙腈－水稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，備用。

樣品溶液:準(zhǔn)確量取1.00 g土壤樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L NaOH/THF(3∶2，體積比)提取液，封口后在恒溫振蕩器中振蕩24 h。靜置沉淀后，將上清液在10 000 r/min速度下離心5 min，分離上清液。將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，最后用H2O/THF(3∶2)溶液定容至1 mL，過(guò) 0.22 μm 微孔濾膜，供 HPCE 分析用［14－16］。

緩沖溶液:稱取一定量的硼砂，用水溶解定容，分別配制成30、50、70 mmol/L的硼砂溶液;稱取一定量的硼酸，用水溶解定容，配制成200 mmol/L的硼酸溶液;根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將硼砂、硼酸溶液按一定比例混合，調(diào)pH值分別為8.4、8.6、8.8、9.0、9.2，過(guò)0.22 μm濾膜，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(60 cm×75 μm);運(yùn)行緩沖液為50 mmol/L硼砂－200 mmol/L硼酸緩沖液(pH 9.0);檢測(cè)波長(zhǎng)220、254 nm;分離電壓23 kV;分離溫度25℃;樣品采用壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力3 448 Pa，進(jìn)樣時(shí)間5 s。

毛細(xì)管柱使用前用1、0.1 mol/L NaOH溶液、水分別清洗20 min。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，每次進(jìn)樣前用0.1 mol/L NaOH溶液平衡毛細(xì)管柱2 min，水沖洗3 min，分析緩沖液平衡3 min［17－18］。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取液的選擇 4種抗球蟲(chóng)藥物中的磺胺、磺胺氯吡嗪、磺胺喹啉均屬于磺胺類藥物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［9］，土壤中磺胺類藥物多采用0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液作提取劑;而土壤中地克珠利的提取方法未見(jiàn)報(bào)道，因地克珠利幾乎不溶于氫氧化鈉水溶液，故將4種藥物混合溶于乙腈的堿溶液、四氫呋喃的堿溶液、N，N-二甲基甲酰胺的堿溶液中，結(jié)果顯示，4種藥物在四氫呋喃堿溶液和N，N-二甲基甲酰胺堿溶液中易溶，在乙腈堿溶液中較難溶。而N，N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)較高，不利于下一步的濃縮，因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液和四氫呋喃的混合液作為提取溶劑。

2.1.2 提取液體積比的確定 兩種提取劑的比例直接影響4種抗球蟲(chóng)藥物的提取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了0.1 mol/L NaOH與THF提取液的體積比分別為2∶3、1∶1、3∶2、3∶1時(shí)對(duì)4種藥物提取率的影響(見(jiàn)圖2)，結(jié)果表明，當(dāng)NaOH與THF的體積比為3∶2時(shí)，4種藥物的提取率均在80%以上。

2.1.3 提取劑用量的確定 提取劑用量會(huì)影響4種藥物的提取效果，用量太少提取不完全;用量太多則會(huì)提取更多的雜質(zhì)［17］。實(shí)驗(yàn)考察了提取劑用量為5、10、15、20 mL時(shí)的提取效果。結(jié)果表明，當(dāng)提取劑用量為5 mL時(shí)，4種藥物的提取率低于80%;當(dāng)提取劑用量為10、15、20 mL時(shí)提取率均能達(dá)到80%以上且無(wú)明顯變化。因此，實(shí)驗(yàn)選擇提取劑用量為10 mL。

圖2 提取液體積比對(duì)4種抗球蟲(chóng)藥提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction ratios on recoveries of four anticoccidial drugs

2.2 電泳分離條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 對(duì)4種抗球蟲(chóng)藥物在190～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(結(jié)果見(jiàn)圖3)，SA在200 nm和254 nm處均有最大吸收，SQX和SCP在254 nm處有最大吸收，DIC在220 nm處有最大吸收。綜合考慮，選擇254 nm作為3種磺胺類藥物的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，用220 nm作為地克珠利的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 4種抗球蟲(chóng)藥的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of four anticoccidial drugs 1.SA，2.DIC，3.SQX，4.SCP

2.2.2 電泳緩沖液種類的影響 緩沖溶液種類對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離效果有明顯的影響。本實(shí)驗(yàn)分別考察了硼砂－硼酸、硼砂－氫氧化鈉、磷酸二氫鉀－硼砂3種不同緩沖體系對(duì)分離效率的影響。結(jié)果表明，磷酸二氫鉀－硼砂緩沖體系的分離效果較差;硼砂－氫氧化鈉緩沖體系基線漂移、噪音較大且遷移時(shí)間較長(zhǎng);而硼砂－硼酸緩沖體系中的峰形較理想，靈敏度較高。因此，選擇硼砂－硼酸作為最佳運(yùn)行緩沖液。

2.2.3 緩沖液pH值的影響 考察了50 mmol/L硼砂－200 mmol/L硼酸緩沖液的pH值為8.4、8.6、8.8、9.0、9.2時(shí)對(duì)DIC、SQX、SCP分離度的影響。結(jié)果表明，緩沖液pH值為9.0和9.2時(shí)，相鄰兩藥物間的分離度均能達(dá)到1.2以上，但pH 9.2時(shí)，遷移時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因此，實(shí)驗(yàn)選用pH 9.0的硼砂－硼酸緩沖液體系。

2.2.4 電泳緩沖液離子濃度的選擇 考察了緩沖體系在pH 9.0，硼酸濃度為200 mmol/L，硼砂濃度為30、50、70 mmol/L時(shí)對(duì)4種藥物分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可以看出，隨著緩沖液離子濃度的增大，遷移時(shí)間相應(yīng)增長(zhǎng)。且遷移時(shí)間均在7.0 min左右，相鄰兩藥物間的分離度只能達(dá)到1.2，不能完全達(dá)到基線分離。因此，選擇不同離子濃度的硼砂－硼酸緩沖液作為正交實(shí)驗(yàn)因子。

由圖還可以看出，磺胺與其它藥物的分離度很大，影響分離效果的主要是其它3種藥物間的分離度，所以本文重點(diǎn)考察了其它因素對(duì)DIC、SQX、SCP 3種藥物間分離度的影響。

2.2.5 分離電壓的影響 在其他條件相同的情況下，考察了分離電壓分別為21、23、25、27、29 kV時(shí)對(duì)后3種藥物分離的影響(結(jié)果見(jiàn)圖5)。由圖可以看出，隨著分離電壓的增加，遷移時(shí)間縮短，但分離度下降，當(dāng)分離電壓為29 kV時(shí)分離度不足1.2，而分離電壓為21 kV時(shí)遷移時(shí)間太長(zhǎng)。因此本實(shí)驗(yàn)選擇23、25、27 kV作為正交實(shí)驗(yàn)因子。

2.2.6 分離溫度的影響 溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率，一般在20～30℃之間進(jìn)行溫度選擇［18－19］。綜合考慮各方面的因素，選擇20、25、30℃作為正交實(shí)驗(yàn)因子。

圖4 離子濃度對(duì)4種藥物分離的影響Fig.4 Effect of ion concentrations on separation of four anticoccidial drugs

圖5 分離電壓對(duì)4種藥物分離的影響Fig.5 Effect of voltages on separation of four anticoccidial drugs

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化最佳分離分析條件，根據(jù)前期探索性試驗(yàn)，選取3個(gè)相對(duì)重要的因素:緩沖體系的離子濃度、分離電壓和溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以L9(33)3因素3水平實(shí)驗(yàn)確立最佳的毛細(xì)管電泳分離條件，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種抗球蟲(chóng)藥的3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 The L9(33)orthogonal experimental design table of four anticoccidial drugs

通過(guò)對(duì)以上多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可知，僅依靠數(shù)學(xué)分析無(wú)法得到正確的結(jié)果，所以綜合考慮實(shí)際中的分離度和遷移時(shí)間［19－20］，選擇第4組實(shí)驗(yàn)為最優(yōu)試驗(yàn)方案。其中，第4組實(shí)驗(yàn)中的4種抗球蟲(chóng)藥物的最小分離度同時(shí)達(dá)到了1.5以上，且遷移時(shí)間較短。因此最佳的電泳分離條件為:緩沖液為50 mmol/L硼砂－200 mmol/L硼酸(pH 9.0);運(yùn)行電壓為23 kV;運(yùn)行溫度為25℃。在最佳的分離條件下對(duì)4種藥物進(jìn)行電泳分離，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 4種抗球蟲(chóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液的電泳圖譜Fig.6 Electropherograms of four anticoccidial drugs mixed standards 1.SA，2.DIC，3.SQX，4.SCP

2.4 線性關(guān)系與精密度

在最佳電泳條件下，對(duì)1.56～50 mg/L 4種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析，考察峰面積(Y)與藥物質(zhì)量濃度(X)的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，在該范圍內(nèi)，4種藥物的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r2)見(jiàn)表2。計(jì)算得到峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=6)小于6%;遷移時(shí)間的RSD(n=6)小于0.2%，方法顯示了良好的精密度。

表2 4種抗球蟲(chóng)藥的線性方程、線性系數(shù)、加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Calibration curves，correlation coefficients，spiked recoveries and RSDs of four drugs

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

在合肥周邊4個(gè)不同養(yǎng)雞場(chǎng)采集4份土壤樣品，按照“1.2”制備樣品溶液，在優(yōu)化電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做2個(gè)平行。其中1、4號(hào)樣品檢出地克珠利，含量分別為1.02、1.24 mg/kg;3號(hào)樣品檢出磺胺氯吡嗪，含量為1.65 mg/kg;而2號(hào)樣品中4種藥物均未檢出(見(jiàn)圖7A)。結(jié)果顯示，目標(biāo)組分得到了很好的分離，且基質(zhì)干擾較小。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

分別向2號(hào)土壤樣品中加入2.0、5.0、10.0 mg/kg 3種水平的4種抗球蟲(chóng)藥標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照“1.2”制備樣品溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在優(yōu)化電泳條件下，得到加標(biāo)土壤樣品的電泳圖(圖7B)。每個(gè)水平平行測(cè)定3次，4種抗球蟲(chóng)藥的回收率在77%～90%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為6.3%～8.1%(見(jiàn)表2)。

圖7 2號(hào)土壤樣品(A)及加標(biāo)土壤樣品(B)的電泳圖Fig.7 Electropherograms of the second soil sample(A)and spiked the second soil sample(B)1.SA，2.DIC，3.SQX，4.SCP

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)提取土壤中兩類抗球蟲(chóng)藥物的前處理方法，該方法提取率高，可有效去除樣品中的雜質(zhì)，色譜圖背景簡(jiǎn)單，無(wú)干擾峰，結(jié)果令人滿意。所確立的毛細(xì)管電泳法與其他分析方法相比，簡(jiǎn)便易行、成本低，為同時(shí)快速檢測(cè)土壤中兩類常用抗球蟲(chóng)藥物提供了一種更有效的分析手段。

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