于秀艷 王文龍 劉曉峰 曾常茜

(吉林省腫瘤醫(yī)院，長春130012)

透骨草(Phryma Leptostachya L.var.asiatica Hara)為透骨草科植物的干燥全草入藥，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，透骨草提取物對人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，并可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，但其相關(guān)的分子機(jī)制尚未完全清楚［1，2］。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot方法觀察透骨草提取物對Hela細(xì)胞PI3k、Akt、mTOR蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討透骨草提取物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，旨在為透骨草提取物抗宮頸癌的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 透骨草采自遼寧金州大黑山，經(jīng)王心毓老先生鑒定為透骨草科植物(Phryma Leptostachya L.var.asiatica Hara);人宮頸癌 Hela 細(xì)胞購自吉林省腫瘤研究所;鼠抗人 PI3k、鼠抗人Akt、鼠抗人mTOR抗體、鼠抗人 β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司;RPMI1640、小牛血清和胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品;RIPA裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜為Sigma公司產(chǎn)品;蛋白電轉(zhuǎn)儀、垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;DU640紫外分光光度計(jì)為美國Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 透骨草提取物制備方法 加熱回流提取法制備透骨草乙醇提取物:取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2小時，過濾，濾液水浴濃縮成干膏。

1.3 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 Hela細(xì)胞用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)，胰酶消化傳代。待Hela細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:透骨草提取物組加入終濃度為100 μg/ml透骨草提取物，對照組加入等體積含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。

1.4 Western blot方法檢測 Hela 細(xì)胞 PI3k、Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平 透骨草提取物組和對照組Hela細(xì)胞在37℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)48小時，分別收集透骨草提取物組和對照組的Hela細(xì)胞，PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑混勻，冰上裂解1小時，4℃12 000 r/min離心20分鐘。收集上清，595 nm波長下用分光光度計(jì)測定樣品OD值，根據(jù)OD值計(jì)算Hela細(xì)胞提取物的蛋白濃度。用細(xì)胞裂解液將透骨草提取物組和對照組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。分別取透骨草提取物組和對照組蛋白60 μg，10%SDS-PAGE 凝膠電泳(80 V，30 分鐘，150 V，90分鐘)，轉(zhuǎn)至 PVDF 膜(200 mA，4℃，1小時)。用50 g/L脫脂牛奶封閉2小時。分別加入鼠抗人 PI3k、Akt、mTOR 抗體(1∶1 000)室溫孵育 2 小時，TBST洗滌3次。分別加入羊抗鼠IgG-HRP抗體(1∶5 000)室溫孵育2小時，TBST洗滌3次。加入ECL試劑A和B等體積混合，1分鐘后將PVDF膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸。1分鐘后，將膜移至保鮮膜上，去盡殘液，曝光，顯影，定影。膠片用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

2 結(jié)果

透骨草提取物對Hela細(xì)胞PI3k、Akt、mTOR蛋白水平表達(dá)的影響結(jié)果見圖1:PI3k蛋白分子量為85 kD，結(jié)果可見在85 kD位置出現(xiàn)陽性條帶，而且與對照組相比，100 μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞后，能夠下調(diào)PI3k蛋白的表達(dá)(P＜0.05);Akt蛋白分子量為60 kD，結(jié)果可見在60 kD位置出現(xiàn)陽性條帶，而且與對照組相比，100 μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞后，能夠下調(diào)Akt蛋白的表達(dá)(P＜0.05);mTOR蛋白分子量為289 kD，結(jié)果可見在289 kD位置出現(xiàn)陽性條帶，而且與對照組相比，100 μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞后，能夠下調(diào)mTOR蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。上述結(jié)果表明透骨草提取物可以抑制Hela細(xì)胞PI3k、Akt和MTOR蛋白表達(dá)。

3 討論

圖1 透骨草提取物對Hela細(xì)胞PI3k、Akt、mTOR蛋白水平表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Phryma Leptostachya L.var.asiatica Hara on the expressions of PI3k，Akt and mTOR proteins in Hela cells

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，PI3k、Akt和mTOR蛋白在宮頸癌的發(fā)生中起重要作用。磷脂酰肌醇-3羥基激酶(PI3k)是磷脂激酶家族中的重要成員，是由一個p110催化亞單位和一個p85調(diào)節(jié)亞單位組成的異源二聚體。Zhang等［3］報道宮頸癌細(xì)胞 PI3k蛋白表達(dá)顯著增加。Jung等［4］研究發(fā)現(xiàn)8-(Tosylamino)喹啉能通過PI3k抑制宮頸癌進(jìn)展。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)一種19 kD磷蛋白 Stathmin能通過PI3k蛋白影響三氧化砷誘導(dǎo)的人宮頸癌細(xì)胞凋亡。Cui等［6］研究發(fā)現(xiàn) MiR-125b能通過作用于 PI3kδ亞單位抑制宮頸癌細(xì)胞生長、促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。上述研究表明PI3k蛋白與多種藥物誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將100 μg/ml透骨草提取物作用于Hela細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)透骨草提取物能夠下調(diào)Hela細(xì)胞PI3k蛋白表達(dá)，表明PI3k蛋白可能與透骨草提取物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Akt是位于PI3k下游的一個重要絲蘇氨酸激酶，是促進(jìn)細(xì)胞生存和維持正常功能的關(guān)鍵信號分子。PI3k能特異性地催化磷脂酰肌醇3-位羥基磷酸化產(chǎn)生具有第二信使作用的磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。PIP3可與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDKl)結(jié)合，促使PDKl磷酸化Akt蛋白的Ser308，從而導(dǎo)致Akt的活化［7］。Paul等［8］報道白屈萊堿通過可以通過AKT蛋白促進(jìn)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。Zhu等［9］3，3'-二吲哚基甲烷對人宮頸癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用與AKT通路有關(guān)。Singh等［10］研究報道茶多酚誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡與抑制Akt活化有關(guān)。Lalaoui等［11］研究發(fā)現(xiàn) TRAIL-R4通過 Akt促進(jìn)人宮頸癌Hela增殖，抑制Hela細(xì)胞凋亡。由此可見Akt蛋白與多種藥物誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將100 μg/ml透骨草提取物作用于Hela細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)透骨草提取物能夠下調(diào)Hela細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)，表明Akt蛋白可能與透骨草提取物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡有關(guān)。

mTOR是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PIKK家族成員，分子量大小為289 kD。mTOR激活后能通過影響核糖體S6蛋白激酶和真核細(xì)胞始動因子4E結(jié)合蛋白這兩個蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子來影響細(xì)胞的生長和分化。Akt可直接活化mTOR蛋白從而影響宮頸癌細(xì)胞的存活和增殖［12］。Li等［13］研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑 AZD8055能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。Yih等［14］研究發(fā)現(xiàn)抑制Akt則能促進(jìn)三氧化二砷誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡。這些研究提示mTOR蛋白與多種藥物誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將100 μg/ml透骨草提取物作用于Hela細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)透骨草提取物能夠下調(diào)Hela細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)，表明mTOR蛋白可能與透骨草提取物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上，透骨草提取物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡可能通過PI3k/Akt/mTOR通路起作用，這為透骨草提取物抗宮頸癌作用的研究提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有關(guān)PI3k/Akt/mTOR信號通路的調(diào)控機(jī)制很復(fù)雜，還有待于更深入的研究。

1 曾常茜，高 松，沈 陽et al.透骨草提取物對腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2009;11(36):1952-1954.

2 于秀艷，曾常茜，高 松et al.透骨草提取物誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制研究［J］.中國免疫學(xué)雜志，2012;7(7):608-610.

3 Zhang X Y，Zhang H Y，Zhang P N et al.Elevated phosphatidylinositol 3-kinase activation and its clinicopathological significance in cervical cancer［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2008;139(2):237-244.

4 Jung Y，Yi Y S，Yoo D S et al.8-(Tosylamino)quinoline inhibits tumour progression through targeting phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway［J］.Pharmazie，2013;68(2):146-152.

5 Wang X，Ren J H，Lin F et al.Stathmin is involved in arsenic trioxide-induced apoptosis in human cervical cancer cell lines via PI3k linked signal pathway［J］.Cancer Biol Ther，2010;10(6):632-643.

6 Cui F，Li X，Zhu X et al.MiR-125b inhibits tumor growth and promotes apoptosis of cervical cancer cells by targeting phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit delta［J］.Cell Physiol Biochem，2012;30(5):1310-1318.

7 Fayard E，Xue G，Parcellier A et al.Protein kinase B(PKB/Akt)，a key mediator of the PI3k signaling pathway［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2010;346:31-56.

8 Paul A，Bishayee K，Ghosh S et al.Chelidonine isolated from ethanolic extract of Chelidonium majus promotes apoptosis in HeLa cells through p38-p53 and PI3k/AKT signalling pathways［J］.Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2012;10(9):1025-1038.

9 Zhu J，Li Y，Guan C et al.Anti-proliferative and pro-apoptotic effects of 3，3 ＇-diindolylmethane in human cervical cancer cells［J］.Oncol Rep，2012;28(3):1063-1068.

10 Singh M，Singh R，Bhui K et al.Tea polyphenols induce apoptosis through mitochondrial pathway and by inhibiting nuclear factor-kappaB and Akt activation in human cervical cancer cells［J］.Oncol Res，2011;19(6):245-257.

11 Lalaoui N，Morlé A，Mérino D et al.TRAIL-R4 promotes tumor growth and resistance to apoptosis in cervical carcinoma HeLa cells through AKT［J］.PLoS One，2011;6(5):e19679.

12 Ji J，Zheng P S.Activation of mTOR signaling pathway contributes to survival of cervical cancer cells［J］.Gynecol Oncol，2010;117(1):103-108.

13 Li S，Li Y，Hu R et al.The mTOR inhibitor AZD8055 inhibits proliferation and glycolysis in cervical cancer cells［J］.Oncol Lett，2013;5(2):717-721.

14 Yih L H，Hsu N C，Wu Y C et al.Inhibition of AKT enhances mitotic cell apoptosis induced by arsenic trioxide［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2013;267(3):228-237.