李國強 劉珍珍 孫晟軒 安廣宇 周海斌

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨外科，蘇州215004)

自1997年Asahara等［1］首次在成人外周血中發(fā)現(xiàn)循環(huán)內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)，使人們對內皮祖細胞的定義和血管形成的概念有了新的認識。血管發(fā)生是一個高度調控的過程，并且在胚胎發(fā)育、組織修復與再生中起著重要作用，其中EPCs在這些過程中可能扮演著重要角色［2］。EPCs具有自我增殖、定向分化的特性，可定向分化為血管、內皮細胞，促進血管新生、修復損傷內膜，在血管組織工程、冠心病的診斷治療上有廣闊的臨床應用前景［3-5］。

對于EPCs的定義國內外存有爭議，現(xiàn)有“兩種EPCs”，一種為形態(tài)上呈“紡錘樣”的 CFU-ECs，另一種則是呈“鵝卵石樣”的 ECFCs［6，7］。目前國際上常用的鑒定EPCs的方法是通過流式細胞儀檢測細胞表面一些分子抗原的表達，如CD34、CD133和血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR-2)［1，8］。但隨著細胞的分化，細胞表面抗原也不斷發(fā)生變化，其中CD34、CD133在細胞體外培養(yǎng)的過程中會逐漸消失［9］，而內皮細胞標志物VEGFR-2的表達逐漸增強。因造血干細胞和內皮祖細胞來源于同一前體細胞，即成血管細胞，在其分化過程中可能存在部分相同的細胞表面抗原［10］，因此單純通過細胞表面抗原來鑒定EPCs并不準確。本文通過細胞表面抗原鑒定、細胞增殖能力、集落形態(tài)、次級集落形成及體外成血管等方法對兩種EPCs進行鑒定，區(qū)別 ECFCs和 CFU-ECs，進而對EPCs建立一個正確、統(tǒng)一的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍血來源 收集6名健康新生產婦臍血，每份約40～100 ml。所有產婦及其家屬均知情并同意。

1.1.2 試劑與儀器 Ficoll淋巴細胞分離液購自Cedarlane公司，CD34磁珠分選試劑及儀器購自stem cell公司，流式細胞分析儀、VEGFR-2-PE、CD31-PE、 CD144-PE、 CD133-FITC、 CD34-FITC，CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP、Matrigel膠購自BD公司，熒光二抗購自Invitrogen，智能生物圖像導航儀FSX100購自OLYMPUS，EBM-2培養(yǎng)基購自MD公司，胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 細胞分離培養(yǎng) 從自愿捐獻者臍靜脈上抽取臍血50 ml左右，肝素抗凝，用等量的PBS稀釋，按2∶1比例加在Ficoll淋巴細胞分離液上，2 600 r/min離心30分鐘，取中間白膜層，用PBS洗滌2遍，計數(shù)。用Easysep免疫磁珠(MACS)人CD34細胞正選試劑篩選CD34+的細胞接種于用纖粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿中，含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。48小時后將未貼壁細胞及細胞碎片移出到新包被培養(yǎng)皿中，48小時后細胞貼壁并換液。原培養(yǎng)皿中貼壁細胞前7天每天更換新鮮培養(yǎng)基，以后隔天換液。見圖1。

1.3 EPCs的鑒定

1.3.1 流式分析 1×105個生長狀態(tài)良好的5代以內細胞與1%BSA稀釋的抗體 VEGFR2-PE、CD31-PE、 CD144-PE、 CD133-FITC、 CD34-FITC、CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP(100 μl/管)，在冰上避光孵育40分鐘，繼而加1 ml的PBS洗2次，混勻后1 500 r/min離心5分鐘。棄上清，加500 μl PBS重懸細胞。流式細胞儀分析，每個樣本收集分析10 000個細胞。

1.3.2 細胞免疫熒光 接種細胞與干凈的蓋玻片上，過夜貼壁后，用4%多聚甲醛固定10分鐘;冷PBS洗一遍，100 μl 1%BSA封閉1小時，分別加抗人CD31、vWF、CD144的鼠單克隆抗體，孵育45分鐘，PBS洗一遍，再加上Alexa 488羊抗鼠二抗，4℃避光孵育20分鐘;PBS洗2次，蒸餾水洗1次，用含DAPI染色劑的封片劑封片后共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 吞噬DiI-Ac-LDL能力 取生長狀態(tài)良好的5代以內細胞，將細胞與 DiI-AC-LDL(10 μg/ml)在37℃孵育1小時，4%的多聚甲醛固定，37℃孵育1小時，PBS沖洗3次，蒸餾水洗1次，向已染色的標本上滴加DAPI，然后再滴加50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 Matrigel的體外血管形成 提前將Matrigel及48孔板放于4℃冰箱過夜，48孔板中每孔加入150 μl Matrigel，放到37℃培養(yǎng)箱中30分鐘。每孔接種4×104個細胞，靜置5分鐘后放到細胞培養(yǎng)箱中。每隔3小時于倒置顯微鏡下觀察血管形成情況。

2 結果

2.1 EPCs形態(tài)特征和集落形成 我們發(fā)現(xiàn)經過CD34+免疫磁珠篩選獲得的EPCs分為貼壁細胞和未貼壁細胞，其形態(tài)完全不同。進一步研究發(fā)現(xiàn)兩種細胞，在細胞大小、增殖能力、集落形態(tài)和集落形成時間等方面存在很大差異，根據其上述特性將貼壁細胞命名 ECFCs，未貼壁細胞命名為 CFU-ECs。ECFCs在分離培養(yǎng)5～14天時形成少量形態(tài)為典型“鋪路石”樣的細胞集落。通過每隔3天用倒置相差顯微鏡觀察細胞的集落形成及增殖過程，發(fā)現(xiàn)14～21天有多個集落形成，ECFCs在傳到25代時仍具有很強的增殖能力。CFU-ECs在4～10天左右出現(xiàn)少量細胞，呈“紡錘體樣”或“梭形”，貼壁梭形細胞從中央向周圍呈放射狀生長，且有梭形細胞排列呈線狀，分別在4、11、18天觀察，未見集落生成，10代左右CFU-ECs生長增殖能力明顯下降。以往研究認為，ECFCs與CFU-ECs在體內或者體外能否形成次級內皮集落形成是判定細胞增殖能力及是否為EPCs的重要指標［12］。我們研究發(fā)現(xiàn)，ECFCs在體外可以形成次級內皮克隆集落，而CFU-ECs不能，這一點也證明 CFU-ECs并非真正的 EPCs，見圖2。

圖1 ECFCs和CFU-ECs的分離和培養(yǎng)Fig.1 Endothelial cells isolated and cultured

圖2 CFU-ECs和ECFCs的細胞集落形成能力Fig.2 The ability of colony formation in two cells

2.2 流式及細胞免疫熒光及 RT-PCR 流式結果發(fā)現(xiàn)ECFCs和CFU-ECs共同表達部分內皮細胞表面標志，如 CD31、CD105、CD146和 VEGFR-2等內皮標志，結果見圖3A。但CFU-ECs表面造血干細胞標志 CD45和吞噬細胞標志CD14高表達，而ECFCs CD34陽性率達75%，CD14及CD45陽性率較低，分別為5%和9%(圖3B)。

圖3 第4代的ECFCs和CFU-ECs的流式檢測結果Fig.3 The expression of different molecular in two cells

圖4 免疫熒光檢測及RT-PCR測定ECFCs和CFU-ECs CD31、CD144和vWF的表達Fig.4 The expression of different molecules in immunofluorescence and RT-PCR

圖5 ECFCs和CFU-ECs攝取DiL-Ac-LDL能力Fig.5 The ability of ECFCs and CFU-ECs intake DiLAc-LDL

圖6 ECFCs和CFU-ECs成血管能力對照Fig.6 The ability of ECFCs and CFU-ECs into vascular

細胞免疫熒光證實兩種細胞表面均有CD31、CD144、vWF的陽性表達，與流式檢測結果相符，見圖4A。RT-PCR檢測兩種細胞 CD34a、CD34b、CD144、VEGFR-2、vWF、CD31 在 mRNA 水平的表達，結果與上述流式及免疫熒光結果相一致，見圖4B。上述結果說明ECFCs和CFU-ECs許多細胞表面標志相同，鑒定細胞標志物并非是鑒定EPCs的金標準。

2.3 DiI-Ac-LDL攝取實驗 圖5為ECFCs和CFUECs攝取Dil-Ac-LDL能力的比較，可以看出兩種細胞都有一定的攝取能力，但ECFCs攝取能力明顯強于CFU-ECs，90%以上 ECFCs可以攝取 DiL-Ac-LDL。由于 CFU-ECs表面作為吞噬細胞標志的CD14陽性率約99%，所以其攝取能力可能為吞噬細胞對Dil-Ac-LDL的吞噬作用。

2.4 血管形成 圖6為兩種細胞成血管情況，發(fā)現(xiàn)ECFCs在3小時時已見明顯血管網狀結構形成，而CFU-ECs在9小時時仍未見血管網狀結構，說明CFU-ECs無血管生成能力。

3 討論

臨床研究結果普遍支持自體EPCs在組織缺血以及損傷血管修復的治療方面具有極大的潛力［11］，但外周血中EPCs的數(shù)量極少，沒有足夠細胞量來滿足臨床應用。而臍血具有取材無創(chuàng)傷、資源豐富、富含早期干細胞等諸多優(yōu)點。Asahara首次在成人外周血中發(fā)現(xiàn)循環(huán)EPCs，但關于ECFCs和CFU-ECs哪一種為真正的EPCs及EPCs的標準鑒定方法一直存在爭議［12］。本研究選擇從臍血中分離擴增EPCs，通過多種方法鑒定ECFCs和CFU-ECs。這兩種細胞來源于不同的祖細胞，CFU-ECs可能來源于造血干細胞。ECFCs的分子表面標記、增殖能力、次級集落形成、攝食Dil-Ac-LDL及成血管能力，推斷其可能為真正的EPCs。

EPCs與心血管疾病相關，已成為一種新型的評估心血管疾病風險的細胞生物標記［13，14］。研究表明，隨著冠心病的Framinghan危險因素評分的增加，血管中循環(huán)EPCs的數(shù)量逐漸減少，相反在缺血和動脈粥樣硬化后的恢復過程中EPCs數(shù)量增加。國外學者認為EPCs數(shù)量的減少是影響心血管功能和促進心血管疾病發(fā)生的重要因素。

在骨折修復與再生方面，Matsumoto等［15］認為CD34+的EPCs和造血干細胞都是細胞系的不同分化階段，如MSCs一樣，CD34+的EPCs和造血干細胞在體內都可以向成骨方向分化［16，17］。骨折的不愈合或延遲愈合很大程度上與骨膜或者骨折附近血供被破壞有關，由于EPCs具有很強的成血管的能力，同時還可以通過旁分泌VEGF促進毛細血管形成，EPCs若能向成骨方向分化，對骨折的治療將會有非常好的應用前景。

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