韓雪花 劉立民 張彥明 張興霞 趙廣圣 司葉俊 林國強 何廣勝 吳德沛

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮安醫(yī)院 淮安市第二人民醫(yī)院中心實驗室，淮安223002)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是血液系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，具有向急性髓系白血病(AML)轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險。研究已經(jīng)證實，MDS患者固有免疫細胞和適應(yīng)性免疫細胞存在質(zhì)或量的異常，如B細胞、T細胞、NK 細胞、單核巨噬細胞[1，2]。Th22 型細胞是一種最新發(fā)現(xiàn)的獨立的輔助性T細胞亞群，是體內(nèi)分泌IL-22的主要細胞，具有促進機體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，使腫瘤細胞的周期停滯在G2/M期，降低細胞增殖率的作用[3，4]。在樹突狀細胞(DC)、漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)刺激的條件下，IL-6和TNF-α可以促進人CD4+初始T細胞向Th22型細胞的分化。TGF-β顯著抑制Th22細胞的分化和IL-22產(chǎn)生[5，6]。我們前期的研究已經(jīng)證實急性髓細胞白血病患者外周血Th22細胞較正常人減少[7]，對于MDS患者體內(nèi)Th22細胞變化情況目前尚無文獻報道，我們通過檢測Th22細胞比例、IL-22和IL-22相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達水平在MDS組及正常對照組外周血中的變化，并初步探討其意義，為進一步研究Th22細胞在MDS免疫機制及發(fā)病機制中的作用提供資料。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2009年9月至2012年3月在我院血液科住院的MDS患者共27例，均按文獻[8]確診，其中男16例，女11例，平均年齡51(18～83)歲。根據(jù)WHO的MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)進行分類，其中難治性貧血(RA)6例，難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細胞增多(RARS)5例，難治性血細胞減少伴多系增生異常(RCMD)4例，難治性貧血伴原始細胞增多(RAEB-Ⅰ、RAEB-Ⅱ)12例。根據(jù)IPSS積分系統(tǒng)進行危險度分級低危(0分)6例，中危-Ⅰ(0.5～1.0分)7例，中危-Ⅱ(1.5～2.0分)8例，高危(≥2.5分)6例。在此基礎(chǔ)上再分為兩組:較低危組(IPSS積分0～1.0分)13例，較高危組(IPSS積分≥1.5分)14例。對照組20名，平均年齡50(25～78)歲，均為健康體檢者，無腫瘤及自身免疫疾病史。各組間年齡、性別無差異，所有觀察對象均于清晨空腹抽取靜脈血3～4 ml，肝素抗凝。

1.2 主要試劑 完全培養(yǎng)基:RPMI1640為Hyclone公司產(chǎn)品，淋巴細胞分離液、胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，CD4-FITC、IL-22-PE單克隆抗體為 BD 公司產(chǎn)品，IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒為上海森雄科技實業(yè)有限公司產(chǎn)品，RNA提取試劑Tripure reagent為Roche公司產(chǎn)品，M-Mulv Reverse Transcriptase購自 Promega公司，IL-22 mRNA引物設(shè)計、合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞及血清樣本準(zhǔn)備 抽取各組研究對象外周血3 ml室溫靜置30分鐘，以1 500 r/min離心15分鐘取其上層血清，于-20℃保存?zhèn)溆?，剩余樣本加PBS液稀釋1倍混勻后加入分離液Ficoll-Hypaque，以1 500 r/min離心10分鐘，收集單個核細胞層于離心管中，以RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2×106細胞/ml，將所得單個核細胞接種于24孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，采用流式細胞術(shù)和RT-PCR分別檢測各組Th22細胞比例、IL-22 mRNA的表達水平。

1.3.2 Th22細胞測定 取各組標(biāo)本單個核細胞用FACS緩沖液(含2%FCS和0.1%疊氮鈉的PBS)洗2遍，于4℃下用10%的羊血清封閉細胞表面抗體15分鐘，調(diào)整細胞濃度2×106ml-1，取100 μl加入CD4-FITC、IL-22-PE 單克隆抗體各 20 μl，另設(shè)同型陰性對照，于4℃下溫育30分鐘后置于流式細胞儀進行檢測。用Th22細胞占外周血CD4+T細胞的比例來評價Th22細胞的水平。

1.3.3 細胞因子測定 用ELISA法測定各組IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 水平，具體實驗步驟按ELISA檢測試劑盒說明書進行。顯色后即刻用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長的光密度D值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 的含量，最小可測值為3.96 pg/ml。

1.3.4 IL-22 mRNA的表達水平檢測 ①取各組標(biāo)本單個核細胞，調(diào)整細胞密度為2×106ml-1，采用TRIzol一步法提取總RNA，操作按說明書進行。紫外分光光度計測定RNA的A260/A260值以確定RNA的純度和總量。②分別取各組 10 μg(5 μl)總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為40 μl，擴增條件為94℃預(yù)變性3分鐘;94℃ 30秒，53℃ 30秒，72℃ 40秒;28個循環(huán)。72℃延伸8分鐘。擴增產(chǎn)物為560 bp。以β-actin為內(nèi)參。③引物設(shè)計合成如下:人IL-22 mRNA上游引物5'-CATAGTGAAGGCAGGAATCACA-3'，下游引物:5'-TAGTCCGAAATGAGGCTGTCTT-3'。β-actin上游引物:5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'，下游引物:5'-AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'。④電泳分析:每個樣品取8 μl擴增產(chǎn)物，行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝取各樣品電泳圖，并通過成像分析軟件Quantity One進行半定量分析。計算樣品中目的基因與β-actin擴增條帶的A值比值，數(shù)據(jù)用±s標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件作數(shù)據(jù)處理，測量指標(biāo)以±s描述，多組間均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

圖1 流式細胞術(shù)檢測MDS患者和正常對照組外周血中Th22細胞所占比例Fig．1 The proportion of Th22 cells in the peripheral blood of MDS patients and healthy donors was evaluated by flow cytometry

表1 MDS患者和正常對照組外周血中 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平(ng/L，±s)Tab．1 IL-22，TGF-β，TNF-α and IL-6 production in the peripheral blood of MDS patients and healthy donors(ng/L，±s)

表1 MDS患者和正常對照組外周血中 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平(ng/L，±s)Tab．1 IL-22，TGF-β，TNF-α and IL-6 production in the peripheral blood of MDS patients and healthy donors(ng/L，±s)

Note:1)P＜0.05 vs control;2)P＜0.05 vs high-grade group.

IL-6 High-grade 14 13.51±3.871) 5.21±1.651) 146.74±29.741) 77.58±16.231)Groups n IL-22 TGF-β TNF-α 0.41 137.95±27.08 Low-grade 13 16.13±4.821)2) 7.46±2.17 1)2) 182.34±37.551)2) 95.62±20.281)2)Control 20 19.72±6.55 9.65±2.78 238.32±5

2.1 外周血Th22細胞水平 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果示MDS較高危組和較低危組Th22細胞占外周血CD4+T細胞比例分別為(0.53±0.13)%和(0.85±0.21)%，明顯低于正常對照組的(1.24±0.31)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。較低危組Th22細胞占外周血CD4+T細胞的比例高于較高危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 外周血 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 的表達水平MDS較高危組和較低危組外周血IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。且較低危組外周血IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平高于較高危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，表1)。

2.3 外周血單個核細胞中Th22細胞的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子IL-22 mRNA的表達水平 MDS較高危組和較低危組外周血單個核細胞中Th22細胞IL-22 mRNA的表達水平分別為0.29±0.06和0.38±0.07，明顯低于正常對照組0.49±0.09，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而較低危組外周血中IL-22 mRNA的表達水平高于較高危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

3 討論

圖2 RT-PCR檢測MDS患者和正常對照組外周血IL-22 mRNA表達Fig．2 IL-22 mRNA of MDS patients and healthy donors was examined by RT-PCR

Th22細胞是近些年來發(fā)現(xiàn)的一群不同于已知的Th1細胞、Th2細胞及Th17細胞的新型CD4+Th細胞亞群，具有分泌IL-22的能力，故稱之為“Th22”細胞[9]，進一步研究證實Th22細胞為CD3+CD4+亞群，CD8、NK細胞表面標(biāo)志物CD56及Foxp3均為陰性，是一類新的、獨立的T細胞亞群[3]。在DC、pDC刺激下，IL-6和TNF-α可以促進人CD4+初始T細胞向Th22型細胞的分化[9]，而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β 顯著抑制 Th22 的分化[5，6]。Th22 細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是芳香烴受體，主要分泌IL-22，還可分泌 IL-10、IL-13、IL-26、腫瘤壞死因子(TNF)-α 等細胞因子，其功能主要是通過IL-22來實現(xiàn)的。研究證實，IL-22通過調(diào)節(jié)上皮細胞的生物學(xué)活性，在抗感染，誘導(dǎo)急性炎性介質(zhì)反應(yīng)，增強宿主防御和上皮屏障功能，參與組織損傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用[10，11]。Th22細胞可誘導(dǎo)補體經(jīng)典激活途徑和旁路途徑中的因子活化，啟動補體的應(yīng)答通路。IL-22可以增強TNF-α的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，加大其促炎作用，這些研究結(jié)果均說明Th22細胞有可能具有促進機體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用。此外，IL-22具有更重要的功能是參與細胞增生、分化以及凋亡的調(diào)節(jié)。在腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-22可調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期，使其停留在G2/M期，降低細胞的增殖率[4]。至于MDS患者體內(nèi)Th22細胞究竟會發(fā)生何種變化此前尚無報道。

在本項研究中我們通過ELISA、流式細胞術(shù)及RT-PCR等檢測發(fā)現(xiàn) MDS較高危組和較低危組Th22細胞及其效應(yīng)因子、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達水平明顯低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，我們也發(fā)現(xiàn)MDS較低危組Th22細胞比例及其效應(yīng)因子、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達水平高于較高危組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示MDS患者體內(nèi)Th22細胞數(shù)量減少，隨著疾病危險度的升高表現(xiàn)更加明顯。說明Th22細胞有可能和MDS的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。MDS患者免疫功能低下除和 DC、pDC、Th17、Treg、NK等細胞相關(guān)外可能和Th22細胞數(shù)量減少也有一定關(guān)系。

ELISA檢測結(jié)果顯示MDS患者外周血中TNF-α、IL-6、TGF-β的水平低于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。較高危組TNF-α、IL-6、TGF-β的水平低于較低危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。已經(jīng)證實在DC、pDC刺激下，IL-6和TNF-α可以促進人CD4+初始T細胞向Th22細胞的分化，而轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β顯著抑制Th22的分化。因此，我們推測可能是在MDS患者體內(nèi)因為DC、pDC數(shù)量減少、功能減低，使其對CD4+初始T細胞的刺激作用減弱，IL-6和TNF-α水平減低使其對CD4+初始T細胞向Th22細胞分化的促進作用減弱，導(dǎo)致了MDS患者體內(nèi)Th22細胞數(shù)量減少。值得一提的是AML患者外周血Th22細胞水平低于正常，而TGF-β的水平高于正常[7]，但在MDS患者外周血Th22細胞及TGF-β水平均低于正常。這提示盡管MDS和AML均屬血液系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，且MDS具有向AML轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險，但MDS同AML相比尚具有自身的特點。對于產(chǎn)生這一結(jié)果的原因目前尚不清楚，有待于作進一步深入研究。Treg細胞在MDS患者外周血中的比例較正常對照組明顯增高[12]，所以，在MDS患者體內(nèi)可能存在Treg等負向免疫調(diào)節(jié)細胞同Th22細胞分化相互拮抗。有關(guān)Th22細胞在MDS免疫機制及發(fā)病機制中的作用有待于作進一步的深入研究。

1 王化泉，邵宗鴻.免疫妥協(xié)與骨髓增生異常綜合征克隆[J].中華血液學(xué)雜志，2005;26(1):60-62.

2 Hamblin T J.Immunology aspects of the myelodysplastie syndmme//Bennett JM.The myelodysplastie syndrome:pathobiology and clinical management[M].New York:Marcel Dekker，2002:65-88.

3 Stefanie E，Kilian E，Davide P.Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling[J].J Clin Invest，2009;119(12):3573-3585.

4 Weber G F，Gaertner F C，Erl W et al.IL-22-mediated tumor growth reduction correlates with inhibition of ERK1/2 and AKT phosphorylation and induction of cell cycle arrest in the G2-M phase[J].J Immunol，2006(11);177:8266-8272.

5 Zheng Y，Danflenko D M，Valdez P et al．Interleukin-22，a Th17 cytokine，mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosia[J].Nature，2007;445(7128):648-651.

6 Duhen T，Geiger R，Jarrossay D et al．Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells[J].Nat Immunol，2009;10(8):857-872.

7 劉立民，張興霞，張彥明 et al.急性髓系白血病患者外周血Th22細胞水平的變化[J].中華血液學(xué)雜志，2012;33(2):133-135.

8 張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京:科學(xué)出版社，2007:184-186.

9 Trifari S，Kaplan C D，Tran E H et al.Identification of a human helper T cell population that has abundant production of interleukin 22 and is distinct from Th17，Th1 and Th2 cells[J].Nat Immunol，2009，10(8):864-871.

10 Sa S M，Valdez P A，Wu J et al.The effects of IL-20 subfamily cytokines on reconstituted human epidermis suggest potential roles in cutaneous innate defeose and pathogenic adaptive immunity in psoriasis[J].J Immunol，2007;178(4):2229-2240.

11 Wolk K，Witte E，Wallace E et al.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense，cellular differentiation and mobility in keratinoeytes:a potential role in psoriasis[J].Eur J Immunol，2006;36(5):1309-1323.

12 王化泉，邵宗鴻，邢莉民et al.骨髓增生異常綜合征患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和Th3細胞變化[J].中華血液學(xué)雜志，2008;29(7):482-484.