趙曉寅 劉 丹 劉 柳 侯亞義 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京210093)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，能夠分化形成脂肪、骨和軟骨等組織，除了具備多向分化潛能，MSC還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力[1]。同時(shí)，取材的廣泛方便、體外擴(kuò)增操作的簡(jiǎn)單迅速及其可塑性使得MSC在臨床治療中有廣闊的應(yīng)用前景。作為臨床應(yīng)用的希望，MSC治療的相關(guān)研究已經(jīng)在許多不同的疾病動(dòng)物模型中展開，包括異體免疫排斥、器官和干細(xì)胞移植、自身免疫和腫瘤免疫等。

免疫細(xì)胞外源性和內(nèi)源性表達(dá)的Toll樣受體(TLR)對(duì)其在天然免疫和獲得性免疫中抵抗入侵者起到十分關(guān)鍵的作用[2，3]。到目前為止，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)的TLR有13個(gè)(人類10個(gè)和小鼠13個(gè))。TLR能夠識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌等多種病原相關(guān)分子模式及某些由宿主產(chǎn)生的分子[4]。TLR能夠被他們特異的配體或激動(dòng)劑活化，從而引起MyD88依賴的或TRIF依賴的下游信號(hào)分子的激活。這些信號(hào)通路的激活觸發(fā)了下游各種細(xì)胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)的分泌[5]。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓、脂肪和臍帶來(lái)源的MSC都能夠表達(dá)TLR，TLR信號(hào)的活化對(duì)MSC的分化、增殖和免疫調(diào)節(jié)功能的影響依然存在爭(zhēng)議[6-15]。因此，本研究分析了TLR3配體——Poly(I:C)對(duì)臍帶MSC表型、細(xì)胞增殖、凋亡、成骨分化以及免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 臍帶取自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科，正常足月妊娠剖宮產(chǎn)胎兒的臍帶。所用材料均嚴(yán)格遵守醫(yī)學(xué)倫理道德，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬認(rèn)可，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和優(yōu)級(jí)胎牛血清(Gibco公司);膠原酶 Ⅱ、中性蛋白酶和透明質(zhì)酸酶(Sigma公司);小鼠抗人 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45和APC-CD105單克隆抗體(ebioscience公司);rmGM-CSF、rmIL-4(Miltenyi Biotec 公司);兔抗小鼠 PE-CD11c、Alexa Flour-CD11c、FITC-CD80、FITC-CD86和APC-MHC-Ⅱ單克隆抗體(ebioscience公司)。

1.2 人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) MSC分離及純化按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法。從手術(shù)室取足月剖腹產(chǎn)的胎兒臍帶，在無(wú)菌狀態(tài)下用預(yù)冷的含0.01%青霉素和鏈霉素的PBS沖洗，去掉臍帶內(nèi)血塊。在DMEM/F12基本培養(yǎng)基中，將臍動(dòng)脈剝除，其余部分剪成2 mm3碎塊，加入250 U/ml的膠原酶Ⅱ，100 U/ml中性蛋白酶，10 U/ml透明質(zhì)酸酶，37℃振蕩消化3小時(shí)至組織基本消化完全，離心去上清，洗3次，培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中(含10%FBS)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L-1于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃恒溫，5%CO2)，3～4天后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，全量換液，待細(xì)胞豐度達(dá)80%左右時(shí)，用2.5 g/L的胰酶消化、傳代。取第3～8代細(xì)胞，分析其表面標(biāo)志，確定其為MSC后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 4～6周的C57BL/6小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較動(dòng)物中心，所有的小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。DC細(xì)胞來(lái)源于小鼠的骨髓。將C57BL/6小鼠斷頸處死，在無(wú)菌條件下取出脛骨和腓骨，置于無(wú)菌PBS中待用;使用注射器吸取PBS，反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨發(fā)白;將骨髓懸液用100目篩網(wǎng)過(guò)濾并收集到離心管中。4℃，1 200 r/min離心5分鐘，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，靜置2分鐘后加入 PBS稀釋，4℃，1 200 r/min離心5分鐘，棄上清，加入 PBS混勻，4℃，1200 r/min離心5分鐘后，收集沉淀的骨髓細(xì)胞。將收集的小鼠骨髓細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml，接種于12孔板中，每孔加入1 ml RPMI1640完全培養(yǎng)基(添加10%FCS胎牛血清，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素，10 ng/ml的GM-CSF，1 ng/ml IL-4)。所有細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下貼壁培養(yǎng);第三天、第五天半量換液，移除不貼壁的細(xì)胞;培養(yǎng)至第六天，通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定，＞90%的細(xì)胞均為CD11c陽(yáng)性。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志

1.4.1 MSC表面標(biāo)志的檢測(cè) 胰酶消化細(xì)胞，PBS洗兩遍，4℃，1 200 r/min，離心5分鐘，棄上清;調(diào)整細(xì)胞密度約每管(1～5)×105個(gè)細(xì)胞。共三例臍帶MSC，每個(gè)標(biāo)記設(shè)三復(fù)孔，按照抗體說(shuō)明書的用量加入同型對(duì)照和相應(yīng)抗體，4℃避光孵育30分鐘，PBS洗三次后，4℃，1 200 r/min，離心5分鐘;用300 μl的PBS充分重懸細(xì)胞，最后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。MSC 檢測(cè)標(biāo)志為:CD117、CD29、CD31、CD44、CD105及CD45。

1.4.2 DC表面共刺激分子的檢測(cè) 將骨髓單核細(xì)胞(5×105cells/孔)與MSC(5×104cells/孔) 于RPMI1640中(添加10%FCS胎牛血清，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素，1 ng/ml IL-4，10 ng/ml GM-CSF)共培養(yǎng)6天，這時(shí)單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為未成熟的DC。向共培養(yǎng)體系中加入10 μg/ml的Poly(I:C)刺激24小時(shí)。由于MSC具有很強(qiáng)的貼壁性，而DC為半貼壁細(xì)胞，根據(jù)DC與MSC不同的貼壁特性，將DC于共培養(yǎng)體系中輕輕吹下回收，流式細(xì)胞儀檢測(cè)了DC細(xì)胞表面CD86、CD40和MHCⅡ的表達(dá)情況。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 CCK-8法是一種基于 WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽]的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)方法。將3～10代的MSC以104cells/孔的密度接種于48孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基中(含10%的FBS，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素)。分別加入1、10、25 和50 μg/ml的 Poly(I:C)處理24小時(shí)和48小時(shí)，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.6 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 壞死細(xì)胞的Annexin V和PI呈雙陽(yáng)性，而凋亡細(xì)胞為Annexin V陽(yáng)性，PI陰性，未凋亡細(xì)胞Annexin V和PI皆呈陰性。操作步驟:分別加入 1、10、25和50 μg/ml的Poly(I:C)處理MSC 24小時(shí)和48小時(shí)后，用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于流式管中;PBS洗兩遍，200 μl binding buffer復(fù)懸(約細(xì)胞 106個(gè)/ml)，加入 2.5 μl Annexin V-FITC;混勻，室溫避光作用10分鐘;加入10 μl 25 μg/ml的PI，避光作用10分鐘;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC吞噬能力 將處理后的DC輕輕吹下培養(yǎng)于24孔板中，加入0.2 mg/ml的FITC-dextran(右旋糖酐)，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘，另設(shè)4℃孵育作為對(duì)照。PBS洗3次后，每管加入300 μl的1.2 mg/ml臺(tái)盼藍(lán)重懸細(xì)胞，以淬滅胞外熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC-dextran陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

1.8.1 小鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞的獲取 將BALB/c小鼠斷頸處死，無(wú)菌條件下取腋下及腸系膜淋巴結(jié)置于預(yù)冷無(wú)菌的RPMI1640培養(yǎng)基中，除去多余的脂肪組織;用注射器針芯將淋巴結(jié)細(xì)胞輕輕擠出;加入5 ml培養(yǎng)基，反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液均勻后，篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，離心，棄上清，培養(yǎng)基洗一遍后，計(jì)數(shù)待用。

1.8.2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) DC分為Control組、Poly(I:C)刺激組、MSC共培養(yǎng)+Poly(I:C)刺激組

(MSC∶DC=1∶10或1∶20)。將T細(xì)胞用 CFSE 標(biāo)記后鋪于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106ml-1，每孔加入100 μl T細(xì)胞后，各處理組的DC與T細(xì)胞按1∶10的比例加入培養(yǎng)體系中，終體積為200 μl/孔，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三天后，流式檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。

1.9 茜素紅S染色 茜素紅染色的原理是基于沉積的鈣可以與茜素紅發(fā)生顯色反應(yīng)并在細(xì)胞外基質(zhì)中被染成橘紅色。將培養(yǎng)板用PBS洗2次，95%的乙醇固定10分鐘，雙蒸水沖洗3次;0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)37℃染色30分鐘;蒸餾水沖洗后顯微鏡下觀察。

1.10 Q-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 用Trizol試劑提取MSC中總的RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系(20 μl):1 μg RNA，4 μl 5 × RT buffer，2 μl dNTP，0.5 μl RNase inhibitor，0.5 μl Oligo dT，0.5 μl ReverTra Ace，加 DEPC 水至 20 μl;反應(yīng)程序:42℃ 20分鐘，99℃ 5分鐘，4℃ 5分鐘。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA進(jìn)行隨后的Q-PCR。Q-PCR反應(yīng)體系(10 μl)為:1 μl cDNA(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按1∶10稀釋)，0.5 μl上游引物，0.5 μl下游引物，5 μl 2 ×TransStart SYBR Green QPCR Supermix，3 μl ddH2O。Q-PCR反應(yīng)程序:95℃ 10分鐘;95℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒(40個(gè)循環(huán)，72℃收集信號(hào));95℃ 15秒，60℃ 30秒，95℃ 15秒(1個(gè)循環(huán)，熔解曲線)。反應(yīng)在ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀中進(jìn)行，得到各個(gè)基因的Ct值，使用2-ΔΔCt方法分析目的基因表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。所用基因的引物由Invitrogen合成，引物序列如表1。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)三次以上，結(jié)果以±s表示，使用 Prism 5(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。One-way ANOVA analysis用來(lái)分析3組及以上數(shù)據(jù)的差異。P＜0.05時(shí)，差異具有顯著性。

表1 mRNA上下游引物序列Tab.1 The primer sequences used in PCR

2 結(jié)果

2.1 Poly(I:C)不改變MSC的表型 取第3～8代的MSC，以105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，Poly(I:C)刺激48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Poly(I:C)的刺激對(duì)MSC表型的影響。結(jié)果顯示，Poly(I:C)處理的MSC對(duì)CD29、CD44(纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質(zhì)細(xì)胞表達(dá))和CD105(即SH-2)表達(dá)呈陽(yáng)性，CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志)、CD45(造血細(xì)胞標(biāo)志)和CD117(多能造血干細(xì)胞標(biāo)志)的表達(dá)呈陰性，與對(duì)照組MSC相同，Poly(I:C)不會(huì)影響MSC的表型(圖1)。經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞成分均一，純度在95%以上。

2.2 Poly(I:C)影響MSC的增殖和凋亡 將MSC以2×104個(gè)/孔鋪于48孔板中，分別用1、10、25和50 μg/ml的 Poly(I:C)刺激 MSC 24或48小時(shí)，CCK-8檢測(cè)對(duì)MSC細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1～50 μg/ml的 Poly(I:C)處理 MSC 24和 48小時(shí)，OD450的值均不發(fā)生改變，TLR3的活化不會(huì)影響細(xì)胞的增殖(圖2A)。隨后，我們用Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)不同濃度Poly(I:C)的刺激對(duì)MSC細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的Poly(I:C)刺激對(duì)MSC沒(méi)有影響，而Poly(I:C)濃度達(dá)到25 μg/ml后會(huì)引起MSC的凋亡(圖2B)。

圖1 人臍帶MSC的表面標(biāo)志Fig.1 The surface marker of human umbilical cord MSC

2.3 Poly(I:C)抑制MSC的成骨分化 MSC具有成骨分化的能力，我們用1 μg/ml和10 μg/ml Poly(I:C)處理MSC共21天，檢測(cè)了Poly(I:C)的刺激對(duì)MSC成骨分化的影響。茜素紅染色結(jié)果顯示，MSC成骨誘導(dǎo)時(shí)加入Poly(I:C)刺激，與對(duì)照組相比，成骨效率明顯降低(圖3A、B)。通過(guò) Q-PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志基因，可見Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runtrelated transcription factor 2，RUNX2)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣蛋白(Osteocalcin，OC)的表達(dá)均明顯降低(P ＜0.05)，圖3C，與染色結(jié)果相符。

2.4 MSC抑制Poly(I:C)引起的DC的成熟和功能

將MSC與骨髓單核細(xì)胞于RPMI1640完全培養(yǎng)基(添加10%FCS胎牛血清，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素，10 ng/ml的 GM-CSF，1 ng/ml IL-4)中共培養(yǎng)7天，單核細(xì)胞被誘導(dǎo)成未成熟DC，加入Poly(I:C)刺激24小時(shí)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11c陽(yáng)性的DC對(duì)MHCⅡ、CD40和CD86的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MSC共培養(yǎng)組的DC對(duì)表面細(xì)胞標(biāo)志CD40、CD86和MHCⅡ的表達(dá)與單獨(dú)Poly(I:C)刺激組的DC相比顯著降低(P＜0.05)(圖4A、B)。結(jié)果說(shuō)明，在Poly(I:C)的刺激下，MSC能夠抑制DC成熟表面標(biāo)志的表達(dá)。

圖2 Poly(I:C)對(duì)MSC的增殖和凋亡的影響Fig.2 The proliferation and apoptosis of MSC after treated with Poly(I:C)

圖3 Poly(I:C)對(duì)MSC成骨分化的影響Fig.3 The Osteogenic differentiation of MSC after treated with Poly(I:C)

圖4 MSC能夠抑制Poly(I:C)引起的DC的成熟和功能Fig.4 MSC can inhibit the maturation and activation of DC with the treatment of Poly (I:C)

未成熟DC具有很強(qiáng)的吞噬功能，隨后我們檢測(cè)了Poly(I:C)刺激下MSC對(duì)DC吞噬功能的影響。結(jié)果顯示，MSC與DC共培養(yǎng)組，DC的吞噬功能比單獨(dú)Poly(I:C)刺激組明顯的增強(qiáng)(圖4C)，說(shuō)明MSC能夠抑制DC的成熟，使其處于未成熟狀態(tài)。成熟的DC能夠?qū)⒖乖f呈給T細(xì)胞，并使其活化，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。我們首先用CFSE標(biāo)記T細(xì)胞，然后將各個(gè)處理組[即Poly(I:C)刺激MSCDC共培養(yǎng)組、單獨(dú)Poly(I:C)刺激DC組、未刺激DC組]的DC與T細(xì)胞按1∶10的比例共培養(yǎng)，3天后流式檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，單獨(dú)Poly(I:C)刺激組DC能夠顯著的促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，而MSC顯著抑制DC細(xì)胞的抗原遞呈功能(圖4D)。以上結(jié)果說(shuō)明，在Poly(I:C)刺激下，MSC能夠抑制DC的成熟和功能。

3 討論

MSC具有自我復(fù)制、多向分化潛能、造血支持、促進(jìn)干細(xì)胞植入、低免疫原性和免疫調(diào)控等特性[16]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓、脂肪和臍帶來(lái)源的MSC都能夠表達(dá)有活性的TLRs[6-12]。

有研究表明TLRs的活化能夠?qū)SC的分化和增殖產(chǎn)生影響[13-15]。Hwa 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，用TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6 和 TLR-9的配體刺激人脂肪來(lái)源的MSC，只有TLR9活化能夠促進(jìn)MSC的增殖。LPS和PGN能夠促進(jìn)MSC的成骨分化，CpG則能夠抑制成骨，另外，Poly(I:C)不影響MSC的成骨或成脂分化。Liotta等[6]的研究則認(rèn)為TLR的活化不影響人骨髓來(lái)源MSC的成骨、成脂和成軟骨。Lombardo等[10]的研究則認(rèn)為，TLR3和TLR4配體刺激能夠促進(jìn)脂肪來(lái)源MSC的成骨分化，但是不影響成脂分化，也不影響細(xì)胞增殖。Raicevic等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，TLR3和 TLR4配體的刺激能夠促進(jìn)骨髓和脂肪來(lái)源MSC的成骨分化，而對(duì)臍帶MSC沒(méi)有影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在Poly(I:C)的刺激下，人臍帶來(lái)源MSC的表型和增殖不發(fā)生改變，但是高濃度的Poly(I:C)會(huì)引起MSC的凋亡;茜素紅染色結(jié)果顯示，Poly(I:C)能夠抑制MSC的成骨分化，同樣成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP和OC的表達(dá)也明顯受到抑制。

關(guān)于TLR對(duì)MSC免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生何種影響仍不清楚。Liotta等[6]的研究發(fā)現(xiàn)TLR3、TLR4的活化會(huì)阻斷人骨髓來(lái)源BMSC對(duì)T細(xì)胞的抑制作用。與此相反，Waterman等[14]的研究則認(rèn)為Poly(I:C)對(duì)MSC短時(shí)間的活化可以長(zhǎng)時(shí)間的使其處于免疫抑制功能增強(qiáng)的狀態(tài)，對(duì)IDO和PGE2的表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，而TLR4的活化則使MSC更傾向于成為一種炎性MSC。Opitz等[7]的研究發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR4的活化能夠促進(jìn)MSC產(chǎn)生IDO，從而促進(jìn)對(duì)T細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)MSC的免疫抑制功能。這些矛盾的結(jié)果可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)。我們將MSC與DC細(xì)胞共培養(yǎng)，加入TLR3配體Poly(I:C)的刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Poly(I:C)存在的情況下MSC能夠抑制DC的活化，增加DC的吞噬功能，使DC趨向于未成熟狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)探討了Poly(I:C)對(duì)人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和功能的影響，發(fā)現(xiàn)了在TLR3配體存在的情況下，MSC依然具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，并且Poly(I:C)的刺激能夠顯著的抑制臍帶MSC的成骨分化。臍帶MSC取材方便且生長(zhǎng)速度快，易于體外大量擴(kuò)增，具有很高的臨床應(yīng)用前景。我們關(guān)于TLR3對(duì)MSC影響的研究為探索炎癥環(huán)境對(duì)MSC影響的機(jī)制以及臍帶MSC的體外應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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