鐘 飛，周衛(wèi)華，張 潔，楊梅松竹，石慧娟，彭英福，李雙杰

（1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首416000；2.湖南省兒童醫(yī)院肝病中心，湖南 長沙410007）

心肌細(xì)胞凋亡是在一定生理和病理?xiàng)l件下，通過特殊信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞“自殺”程序，在基因調(diào)控下進(jìn)行的程序化死亡。目前認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[1]。心肌組織死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Daxx）是（death domain-associated protein，Daxx）是Yang[2]等在1997年發(fā)現(xiàn)的一種Fas 死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，可激活c-Jun 氨基末端激酶 （c-Jun Nterminal kinase，JNK） 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；研究顯示，干預(yù)Daxx 在心肌中的表達(dá)，可減少大鼠心肌梗死的面積與心肌細(xì)胞的凋亡[3]，我們推測Daxx 可能成為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡新的重要藥理作用靶點(diǎn)，我們以前的研究表明黃芪甲苷具有減少阿霉素性致心肌細(xì)胞凋亡作用，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討黃芪甲苷調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD 大鼠30 只，SPF 級，體質(zhì)量200～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 藥物 黃芪甲苷(成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司)，保存于4 ℃冰箱，用甲基纖維素鈉配成5 mg/mL；阿霉素（購自湘西自治州腫瘤醫(yī)院）。

1.1.3 試劑 山羊抗Daxx 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IG、β-actin 小鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠IG、complete TM pretease inhibitor cocktail tablet，均由Santa 公司公司提供。PageRulerTM Puls pertained protein ladder(fermentas 公司)；硝酸纖維膜、BCA 蛋白濃度測定試劑盒，ECL 超敏化學(xué)發(fā)光試劑，均由江蘇南通碧云天生物技術(shù)研究所提供；RIPA Lysis buffer(Millipore 公司)；PE 導(dǎo)管（內(nèi)徑0.58 mm，外徑0.99 mm，美國健康醫(yī)療儀器國際公司）。

1.1.4 儀器 TGL-16G 冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))；723 可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；萊卡切片機(jī)（RM2126 上海）；全自動生物組織脫水機(jī)（YD-12G 金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；生物組織包埋機(jī)(YD-6L 產(chǎn)地金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計（UV-3100 產(chǎn)地上海美普達(dá)儀器有限公司），DYCZ 雙板夾芯式垂直槽 （北京六一廠）；半干式碳板轉(zhuǎn)移電泳槽 （北京六一廠）；BL-420E 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠隨機(jī)分為3 組，即空白組、模型組、黃芪甲苷組，每組10 只。

1.2.2 造模方法 參照文獻(xiàn)用阿霉素造模[4]2.5 mg/kg，隔日1 次腹腔注射，每周3 次，共2 周，總劑量為15 mg/kg。

1.2.3 給藥方法 空白組采用生理鹽水0.6 mL 腹腔注射，隔日1 次，共6 次，同時用1%羧甲基纖維素鈉1 mL，灌胃1 次／d。模型組采用阿霉素造模(2.5 mg/kg，隔日1 次腹腔注射，共6 次，總劑量為15 mg/kg)；同時灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉1 mL，1 次/d。黃芪甲苷組造模方法同模型組，同時灌胃給予黃芪甲苷[5]30 mg/kg(用1 mL 1%甲基纖維素鈉溶解)，1 次/d 灌胃，連續(xù)2 周。

1.2.4 心功能檢測 最后1 次阿霉素處理24 h 后，用20%烏拉坦4 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，頸部正中切口，游離右頸總動脈，經(jīng)右頸總動脈向左心室插入自制的心室插管（內(nèi)徑0.58 mm，外徑0.99 mm）導(dǎo)管內(nèi)充滿1%的肝素，穩(wěn)定20 min后，用數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)測量左室收縮壓（LVSP）、左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）等心功能指標(biāo)。

1.2.5 心肌損傷理學(xué)檢測 心功能測定后，斷頭處死，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈殘血，取部分心肌10%的甲醛固定24 h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm，HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果并照相。

1.2.6 心肌生化指標(biāo)的檢測 心功能測定后，斷頭處死，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈殘血，取中下部分心肌，-80 ℃保存?zhèn)溆?，取部分心肌勻漿測定丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，TBA法測定MDA 含量，羥胺法測定SOD 活性，蛋白質(zhì)定量用BCA 法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7 蛋白電泳和蛋白免疫印跡 （western-blot）檢測死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Daxx）表達(dá) 取心肌組織約50 mg，用用預(yù)冷的RIPA Lysis buffer 加omplete TM pretease inhibitor 500 μL，用勻漿器破碎細(xì)胞，4 ℃，12 000 g，離心10 min，取上清液，用BCA 法蛋白定量，取100 μg 蛋白，10%分離膠和4%濃縮膠SDS-PAGE 膠電泳3 h，蛋白經(jīng)半干電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，10%脫脂奶粉封閉1 h，加山羊抗大鼠Daxx 抗體（1∶500），4 ℃過夜，TTBS 洗3 次，10 min/次，驢抗山羊IG（1∶1 000），37 ℃振蕩孵育2 h，TTBS 洗3 次，10 min/次，加ECL 反 應(yīng) 液5 min，暗室暴光，壓片，用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用“±s”表示，組間比較用方差分析和兩兩比較S-N-K 法，P＜0.05 示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對大鼠心臟LVSP、±dp/dtmax 等心功能的影響

與空白組相比，模型組大鼠心肌LVSP，±dp/dtmax 等指標(biāo)顯著降低，提示其心功能顯著下降。灌胃給予黃芪甲苷后，大鼠心肌LVSP，±dp/dtmax 等指標(biāo)與模型組相比明顯改善。結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷對大鼠心臟LVSP，±dp/dtmax等心功能的影響 （±s，n=10，mmHg/s）

表1 黃芪甲苷對大鼠心臟LVSP，±dp/dtmax等心功能的影響 （±s，n=10，mmHg/s）

注：與空白組相比**P＜0.01，與模型組相比＃P＜0.05。

組 別空白組模型組黃芪甲苷組LVSP 135.64±11.2 96.82±7.46**119.17±10.23＃+dp/dtmax 5 769±1 104 2 876±976**4 376±1 146＃-dp/dtmax 5 216±1 214 2 347±942**3 615±1 087＃

2.2 黃芪甲苷對阿霉素大鼠心肌組織病理的影響

空白組心肌細(xì)胞排列整齊，胞核清晰，無心肌纖維的破壞，細(xì)胞間隙正常，未見水腫，組織間隙無炎性滲出。模型組心肌細(xì)胞腫脹，排列紊亂，心肌纖維減少，肌原纖維斷裂，多灶性壞死，心肌壞死灶內(nèi)可見單核、淋巴細(xì)胞浸潤。黃芪甲苷組病變明顯減輕，心肌細(xì)胞水腫減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肌原纖維排列較整齊，心肌細(xì)胞胞間隙增寬，心肌間可見部分紅細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 黃芪甲苷對阿霉素大鼠心肌組織病理影響的光鏡圖(HE 染色，×400)

2.3 黃芪甲苷對心肌生化指標(biāo)的影響

模型組大鼠心肌組織MDA 含量升高，與空白相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組大鼠心肌組織SOD 和GPX 活性下降，與空白相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；灌胃給予黃芪甲苷后，大鼠心肌組織MDA 含量下降，大鼠心肌組織SOD 和GPX 活性升高，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 黃芪甲苷對大鼠心肌組織SOD、GPX 活性和MDA 含量的影響 （±s，n=10）

表2 黃芪甲苷對大鼠心肌組織SOD、GPX 活性和MDA 含量的影響 （±s，n=10）

注：與空白組相比**P＜0.01，與模型組相比△P＜0.05。

組 別空白組模型組黃芪甲苷組SOD(U/mg)18.40±2.98 10.79±1.96**15.48±2.49△GPX(U/mg)42.56±5.29 28.74±3.67**35.08±2.95△MDA(nmol/mg)9.36±1.34 16.34±2.86**12.82±1.89△

2.4 western-blot 結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠心肌組織Daxx 增加至正常水平的（2.95±0.38）倍(P＜0.01)，黃芪甲苷灌胃給藥后大鼠心肌組織中daxx 的表達(dá)增加至正常水平的（1.93±0.46）倍，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖2。

3 討論

圖2 大鼠心肌組織中Daxx 蛋白免疫印跡檢測圖

普遍認(rèn)為阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷與過量氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)[1，6]，它導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞膜的直接損害。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠心肌組織中得MDA 含量顯著升高，SOD 和GSH-PX 活性顯著降低（P＜0.05），表明ADR 引起明顯心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，這與文獻(xiàn)報道一致[7]。模型組病理結(jié)果可見心肌細(xì)胞腫脹，排列紊亂，心肌纖維減少，肌原纖維斷裂，多灶性變性和壞死；測定LVSP、±dp/dtmax 等心功能指標(biāo)，模型組LVSP，±dp/dtmax 等指標(biāo)顯著惡化，阿霉素組大鼠出現(xiàn)了左室收縮功能障礙，證實(shí)阿霉素心肌損傷模型是成功的。

近年來的研究證實(shí)阿霉素導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡在其對心肌的毒性損傷機(jī)制中起重要的作用[8]。Fas（CD95）為死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員。FasL（又名CD178）為腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體。當(dāng)表達(dá)Fas 的靶細(xì)胞和活性細(xì)胞的FasL 交聯(lián)后，啟動凋亡信號傳導(dǎo)途徑，從而激活Fas/FasL 途徑下游的白細(xì)胞介素-1β 轉(zhuǎn)化酶的相關(guān)蛋白酶系列，引起核酸內(nèi)切酶活化，降解DNA 修復(fù)酶及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，最終導(dǎo)致Fas 表達(dá)陽性的靶細(xì)胞凋亡[9]。Fas/FasL 系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)途徑是許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Kim 研究首先證實(shí)daxx 在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10]，H2O2處理細(xì)胞能誘導(dǎo)Daxx 表達(dá)上調(diào)，而用反義寡核苷酸抑制daxx 的表達(dá)能抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yaniv 研究[11]進(jìn)一步探明了daxx誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，首先H2O2激活Fas，F(xiàn)as的死亡結(jié)構(gòu)域可與Daxx 的C 末端一個功能區(qū)結(jié)合，通過激活C-Jun 氨基末端激酶（JNK）途徑而啟動凋亡的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，daxx 在阿霉素心肌損傷大鼠心肌中表達(dá)升高，表明daxx 可能通過Fas-daxx-JNK 介導(dǎo)了阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

黃芪甲苷為中藥黃芪的重要的活性成分，研究表明其對病毒性心肌炎具有良好的治療效果，能改善病毒性心肌損傷大鼠心功能、減輕心肌損傷病理改變[12]。我們以前的研究證實(shí)黃芪甲苷可以顯著減少阿霉素所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[13]；本研究表明黃芪甲苷能降低阿霉素大鼠心肌組織MDA 含量，升高SOD 和GSH-PX 活性；明顯減輕其病理改變程度，黃芪甲苷能下調(diào)阿霉素心肌損傷大鼠心肌組織daxx 的表達(dá)從而起到抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，明顯改善其心功能。綜上所述daxx 在阿霉素心肌損傷大鼠心肌中表達(dá)上調(diào)，并在阿霉素心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，黃芪甲苷能下調(diào)daxx 的表達(dá)，改善阿霉素心肌損傷大鼠的心功能，減輕病理損害，其機(jī)制可能與其清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)。

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