高海濤，邵鄰相，成文召，陳康麗，許爭爭，吳云飛，張璐敏

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

飲食限制(dietary restriction，DR)又稱熱量限制，是指提供機體充足的營養(yǎng)成分如氨基酸、脂肪酸、維生素等，在保證機體不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，限制每日攝入的總熱量.研究表明，飲食限制能增強自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)的功能［1］、延緩衰老［2］、延長壽命［3］、預(yù)防心血管疾病和糖尿?。?］、增強機體抗氧化能力［5］.長期營養(yǎng)過?？梢鸶咧Y、肥胖癥，導(dǎo)致壽命縮短、智力障礙、免疫能力低下等［6-9］.如果能通過限食的方式預(yù)防和治療高脂血癥等營養(yǎng)過剩性疾病，既經(jīng)濟方便，又能避免藥物引起的副作用.但飲食限制是否會對機體造成不良影響，何種程度限食最為有益?目前尚無定論.本文在建立高脂小鼠模型的基礎(chǔ)上，研究了飲食限制對高脂小鼠體質(zhì)量、血脂和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為預(yù)防和治療高脂血癥等營養(yǎng)過剩性疾病及合理膳食提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J 小鼠，雄性，平均體質(zhì)量(22.0 ±1.0)g，清潔級，購于上海斯萊克實驗動物中心，合格證號:SCXK(滬)2007-0005.總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，購于南京建成生物工程研究所.Thermo Scientific 全波長酶標(biāo)儀，美國Electron 公司;SLY-WMS-水迷宮系統(tǒng)，北京碩林苑科技有限公司;Ultrospec 4000 分光光度計，英國Biochrom 公司;3K18 冷凍離心機，德國SigMa 公司.

高脂飼料:面粉44%，淀粉11.75%，玉米粉9%，麩皮7%，酵母粉4%，魚粉4%，豆粕4%，骨粉1%，魚肝油1%，食鹽1%，膽固醇1%，膽酸鈉0.25%，豬油12%.

1.2 小鼠高脂模型的建立及分組處理

52 只C57BL/6J 小鼠隨機分成2 組:正常組12 只;高脂組40 只，按文獻［10］建立高脂小鼠模型.將40 只高脂小鼠隨機分成模型組(自由飲食)和20%，40%，60% 飲食限制組(標(biāo)記為DR20%組、DR40%組和DR60%組).各限食組小鼠分別按模型組小鼠平均飲食量的80%，60%和40%定時飼喂高脂飼料.每天測定小鼠體質(zhì)量，28 d后測定小鼠血清中TC，TG，HDL-C 和LDL-C的含量.開場實驗和水迷宮實驗后解剖小鼠，測定小鼠各器官的臟器系數(shù)和Lee′s 指數(shù).

1.3 TC，TG，HDL-C 和LDL-C 含量測定

小鼠禁食12 h，不禁水，尾靜脈取血50 μL，3 000 r/min 離心15 min，取血清，根據(jù)TC，TG，HDL-C 和LDL-C 試劑盒的使用說明，按V樣本∶V工作液=1∶100 取2 μL 血清和200 μL 工作液于96 孔板上，酶標(biāo)儀測定血清中TC，TG，HDL-C 和LDL-C 的含量.

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力測試

用開場行為實驗［11］和Morris 水迷宮實驗［12］測試小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力.

1.5 臟器系數(shù)和Lee's 指數(shù)測定

測量小鼠的體長和體質(zhì)量，稱量其心、肝、脾和腎等臟器的濕質(zhì)量，按公式(1)計算臟器系數(shù)，按公式(2)計算Lee′s 指數(shù).

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 飲食限制對高脂小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 小鼠體質(zhì)量的變化曲線

從圖1 可見:DR20%組、DR40%組和DR60%組小鼠的體質(zhì)量隨時間的推移而逐漸減小，且減小的速率依次增大;模型組小鼠的體質(zhì)量相對恒定，有增加的趨勢.如表1 所示:與模型組相比，DR20%組、DR40%組和DR60%組小鼠的體質(zhì)量均顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01);與初始體質(zhì)量相比，DR40%組和DR60%組小鼠的體質(zhì)量均顯著減小(P ＜0.01).

表1 小鼠初始體質(zhì)量和最終體質(zhì)量(n=10)

2.2 飲食限制對高脂小鼠臟器系數(shù)和Lee's 指數(shù)的影響

如表2所示:DR20% 組、DR40% 組 和DR60%組小鼠的脂肪系數(shù)和Lee′s 指數(shù)均顯著小于模型組(P ＜0.01 或P ＜0.05);DR40%組和DR60%組小鼠的肝系數(shù)顯著大于模型組(P ＜0.01)，脾系數(shù)顯著小于模型組(P ＜0.01);各組間心系數(shù)和腎系數(shù)均無顯著差異(P ＞0.05).

表2 各組小鼠的臟器系數(shù)和Lee′s 指數(shù)(n=10)

2.3 飲食限制對高脂小鼠血脂的影響

表3 顯示:模型組和各飲食限制組小鼠血清中TC、TG 和LDL-C 含量依次減少，HDL-C 含量依次增加;與模型組相比，DR20%組、DR40%組和DR60%組的TG 含量顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.01);DR60%組的TC 和LDL-C 含量均顯著降低(P ＜0.05);DR40%組和DR60%組的HDL-C 含量極顯著升高(P ＜0.01).

表3 飲食限制對高脂小鼠血清中TC，TG，HDL-C 和LDL-C 含量的影響(n=10) mg/mL

2.4 飲食限制對高脂小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表4 顯示:飲食限制各組小鼠的站立次數(shù)大于模型組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.05);1 min 爬動格數(shù)和3 min 爬動格數(shù)有增大趨勢，但亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.05).DR20%組小鼠的理毛次數(shù)顯著小于模型組(P ＜0.05).各組小鼠的終/始潛伏期相比，分別縮短了37.02%，68.01%，74.77%和63.80%，差異極顯著(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01，P ＜0.01);此外，各飲食限制組小鼠的終潛伏期顯著小于模型組(P ＜0.05.見圖2).

表4 飲食限制對高脂小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(n=10)

3 討論

飲食限制程度較低時，動物通過調(diào)整自身的代謝和活動行為來調(diào)節(jié)自身的能量支出，從而維持自身的能量平衡和體質(zhì)量相對穩(wěn)定.然而，隨著限食程度的加大，動物不能通過調(diào)節(jié)能量的攝入和支出來彌補限食所導(dǎo)致的食物缺乏，單以糖為主要能源不能滿足機體的需求，脂肪動員增加，即脂肪水解為脂肪酸和甘油，從而表現(xiàn)為體內(nèi)脂肪減少、體質(zhì)量降低和Lee′s 指數(shù)降低.故本實驗中，飲食限制各組小鼠的體質(zhì)量、脂肪系數(shù)和Lee′s指數(shù)均顯著降低.脂肪系數(shù)和Lee′s 指數(shù)能夠評價動物的肥胖程度.研究結(jié)果表明，飲食限制對高脂小鼠有顯著的減肥作用.臟器系數(shù)是衡量動物體質(zhì)健康的重要指標(biāo)，當(dāng)臟器損傷時，臟器系數(shù)會發(fā)生改變.本研究中，對高脂小鼠限食一段時間后，其肝系數(shù)增大，這與邵鄰相等［13］用非高脂小鼠研究的結(jié)果相一致.脾是動物體內(nèi)重要的免疫器官，DR40%組和DR60%組小鼠的脾系數(shù)顯著降低，說明高程度限食可能對小鼠的脾臟造成損傷，從而影響其免疫能力.

高脂血癥是由于脂肪代謝或運轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或多種脂質(zhì)含量高于正常范圍的病癥，如高膽固醇(TC)血癥、高甘油三脂(TG)血癥、混合高脂血癥(血清膽固醇及甘油三酯均升高)、高密度脂蛋白(HDL)低下.HDL 能運載周圍組織中的膽固醇到肝臟中進行代謝，轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出體外，從而降低患高脂血癥的風(fēng)險.王艷莉等［14］研究認(rèn)為，高脂飼喂能導(dǎo)致大鼠脂代謝紊亂，表現(xiàn)為TC、TG 等含量顯著升高.本實驗中，飲食限制組小鼠血清中TC、TG 和LDL-C 含量都有不同程度的減少，HDL-C 含量有不同程度的增加，說明飲食限制能夠治療脂代謝紊亂，具有顯著的降血脂作用.這與降血脂藥物洛伐他丁的降血脂效果［15］相一致.提示飲食限制能夠降低高脂血癥患者血清中的血脂含量，可預(yù)防和治療高血脂癥，還能避免藥物引起的副作用.

動物在開場底面上的跑動反映了動物的自發(fā)活動狀態(tài)，站立(扶壁站立和懸空站立)反映了動物處在新異環(huán)境中的探究能力.水迷宮實驗［12］能測定動物的空間記憶能力.潛伏期是指小鼠找到并爬上平臺所需要的時間，潛伏期越短，小鼠的空間記憶能力越強.研究表明，飲食限制能緩解小鼠的焦慮和抑郁行為［16］;限食20%能提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［17］.本實驗結(jié)果顯示，各限食組小鼠的站立次數(shù)多于模型組，潛伏期均顯著短于模型組，說明飲食限制能增強高脂小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力.這與文獻［5，13］用非高脂小鼠研究的結(jié)果相一致.李姣等［5］研究認(rèn)為，適當(dāng)水平的飲食限制能提高小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力，使其空間記憶能力增強.高膽固醇血癥可引起動物的學(xué)習(xí)記憶障礙［18］.本研究還發(fā)現(xiàn)，高脂小鼠的血脂濃度降低，其學(xué)習(xí)記憶能力增強.這可能是因為飲食限制降低了血脂濃度，從而降低了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對腦細(xì)胞的損傷.飲食限制能夠促進大腦產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，保護神經(jīng)細(xì)胞免受高脂飲食所引起的氧化應(yīng)激造成的損傷［19］，也可能是飲食限制增強高脂小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的原因.高脂血癥與肥胖密切相關(guān)，而肥胖兒童的智商低于正常兒童［7，20］，說明肥胖能影響兒童的學(xué)習(xí)記憶能力.本研究結(jié)果提示，嚴(yán)格控制飲食能夠有效預(yù)防和治療肥胖兒童的智力低下.

綜上所述，飲食限制對高脂小鼠具有顯著的減輕體質(zhì)量和降血脂作用，增強其學(xué)習(xí)記憶能力.限食20%～40%效果較好.通過合理限食預(yù)防和治療高脂血癥等營養(yǎng)過剩性疾病，既經(jīng)濟衛(wèi)生，又低碳環(huán)保，還能避免藥物對身體的副作用.在此，建議通過適量限食來預(yù)防和治療營養(yǎng)過剩性疾病.

致謝:感謝浙江師范大學(xué)徐曉虹教授和張勤研究生在開場實驗和水迷宮實驗方面給予的技術(shù)指導(dǎo);感謝吳依妮、顧曉斌、袁勇等在實驗操作方面給予的幫助.

［1］Rogers C J，Berrigan D，Zaharoff D A，et al.Energy restriction and exercise differentially enhance components of systemic and mucosal immunity in mice［J］.Journal of Nutrition，2008，138(1):115-122.

［2］Gonzalez O A，Tobia C，Ebersole J L，et al.Caloric restriction and chronic inflammatory diseases［J］.Oral Diseases，2012，18(1):16-31.

［3］Kouda K，Iki M.Beneficial effects of mild stress (hormetic effects):dietary restriction and health［J］.Journal of Physiological Anthropology，2010，29(4):127-132.

［4］Mager D E，Wan Ruiqian，Brown M，et al.Caloric restriction and intermittent fasting alter spectral measures of heart rate and blood pressure variability in rats［J］.Faseb Journal，2006，20(6):631-637.

［5］李姣，邵鄰相，張均平，等.飲食限制對小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26(5):592-593.

［6］Yang Zhou，Hall A G.The financial burden of overweight and obesity among elderly Americans:the dynamics of weight，longevity，and health care cost［J］.Health Serv Res，2008，43(3):849-868.

［7］Olsson G M，Hulting A L.Intellectual profile and level of IQ among a clinical group of obese children and adolescents［J］.Eating and Weight Disorders-Studies on Anorexia Bulimia and Obesity，2010，15(1/2):E68-E73.

［8］Lamas O，Marti A，Martinez J A.Obesity and immunocompetence［J］.European Journal of Clinical Nutrition，2002，56(Suppl 3):42-45.

［9］Shi Lei，Liu Zhongwu，Li Yun，et al.The prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and its association with lifestyle/dietary habits among university faculty and staff in Chengdu［J］.Biomed Environ Sci，2012，25(4):383-391.

［10］邵鄰相，高海濤，吳依妮，等.魔芋膠對高脂小鼠血脂和抗氧化能力的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2013，36(2):205-208.

［11］尹明華，徐曉虹，姜科聲.燈盞花素對缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的保護作用［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42(7):497-500.

［12］Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11(1):47-60.

［13］邵鄰相，李姣，徐玲玲，等.飲食限制58 d 對小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，34(1):81-85.

［14］王艷莉，翟成凱，陳晗，等.高脂飼料喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)的脂代謝紊亂對糖代謝及炎癥因子的影響［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(2):190-193.

［15］Li Xiaorong，Wang Lijuan，Li Yuhang，et al.Polysorbates as novel lipid-modulating candidates for reducing serum total cholesterol and lowdensity lipoprotein levels in hyperlipidemic C57BL/6J mice and rats［J］.European Journal of Pharmacology，2011，660(2/3):468-475.

［16］Yamamoto Y，Tanahashi T，Kawai T，et al.Changes in behavior and gene expression induced by caloric restriction in C57BL/6 mice［J］.Physiol Genomics，2009，39(3):227-235.

［17］Deng Li，Wu Zhining，Han Peizhuo.Effects of different levels of food restriction on passive-avoidance memory and the expression of synapsin I in young mice［J］.International Journal of Neuroscience，2009，119(2):291-304.

［18］趙玲，李雅莉，靳洪濤，等.何首烏提取物對高膽固醇血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶及血脂的影響［J］.中草藥，2004，35(11):1277-1279.

［19］Duan Wenzhen，Lee J，Guo Zhihong，et al.Dietary restriction stimulates BDNF production in the brain and thereby protects neurons against excitotoxic injury［J］.Journal of Molecular Neuroscience，2001，16(1):1-12.

［20］Yu Zhangbin，Han Shuping，Cao Xingguo，et al.Intelligence in relation to obesity:a systematic review and meta-analysis［J］.Obesity Reviews，2010，11(9):656-670.