梁宏儒，高佳濱，李安，陳為宏，喬波，尹輝，胡旭，趙達，姜東君，朱戰(zhàn)波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

牛傳染性鼻氣管炎是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥為主要特征，還能引起母牛流產(chǎn)和產(chǎn)死胎、成年牛腸炎和犢牛腦炎，有時引起結(jié)膜炎和角膜炎，繼發(fā)性的細菌感染能導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道疾病[1-2]，世界動物衛(wèi)生組織將本病列為B 類疾病，也是我國進境動物的必檢疾病之一。牛傳染性鼻氣管炎病毒也稱牛皰疹病毒I 型（BHV-1），系球形有囊膜的雙股DNA 病毒，直徑約130～80 nm，對乙醚、氯仿、丙酮敏感。病毒在pH 6.9～9.0 時穩(wěn)定，在pH 4.5～5.0 下可被滅活。病毒在4 ℃可保存1 個月，-60 ℃可保存9 個月，37 ℃存活10 d 左右，對凍干、凍融也很穩(wěn)定，但在63 ℃以上數(shù)秒內(nèi)可被滅活。目前通過基因分析和抗原鑒定一共發(fā)現(xiàn)3 種基因型：1、1.2 a、1.2 b。1 型病毒通常從侵染的鼻氣管中分離，并能夠從呼吸道和流產(chǎn)的胎兒中分離，該病毒主要流行于歐洲、北美和南美；1.2 a 型病毒能引起許多臨床疾病，如呼吸道疾病、陰道炎、流產(chǎn)和龜頭炎，目前多流行于巴西；1.2 b 型病毒與呼吸道疾病和陰道炎以及龜頭炎有關(guān)，但是不會導(dǎo)致流產(chǎn)[3]，致病力最弱。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法具有很高的靈敏度而能夠在檢測牛血清中微量的IBRV 的優(yōu)點。特別是對IBRV 的潛伏感染的確診，其特異性強。疫苗接種是最重要的預(yù)防和控制措施，其中滅活疫苗因在使用過程中具有較好的安全性，在種公牛、母牛和經(jīng)濟價值高的奶牛群中得到廣泛應(yīng)用[4]。

1 材料和方法

1.1 臨床癥狀

2012年12 月黑龍江某牛場奶牛突然發(fā)病，病牛主要表現(xiàn)為體溫升高、達41.5 ℃，精神萎頓，食欲減退近廢絕，產(chǎn)乳量急劇下降，呼吸加快，伴有咳嗽、流淚、大量黏膿性鼻汁，鼻黏膜發(fā)炎，鼻唇鏡高度充血呈紅色，依據(jù)臨床癥狀初步診斷為牛傳染性鼻氣管炎病毒感染。

1.2 病料的采集與處理

用無菌棉簽采集發(fā)病牛鼻腔分泌物，將牛鼻腔棉拭子放入裝有病毒分離運輸培養(yǎng)基的滅菌離心管中帶回實驗室。在超凈臺內(nèi)將采集的牛鼻腔棉拭子用少量運輸培養(yǎng)基充分洗滌后，離心取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，得到待分離病毒樣品，放入-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞

MDBK 細胞由本實驗室保存。

1.4 主要試劑

ExTaq 和dNTP 為TaKaRa 公 司 產(chǎn) 品；DNA Marker 為康為世紀(jì)科技（北京）有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA 提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白酶、DMEM 為Gibco 公司產(chǎn)品；新生犢牛血清購自杭州四季青公司；甲醛為沈陽市華東試劑廠出品。

1.5 PCR 檢測

根據(jù)參考文獻[4]設(shè)計IBRV gB 基因序列引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。擴增片段大小為362 bp。引物序列為GH-1：GGCTCTACCGCACGGG CACCTCT，GH-2：GCGGCTCTCGTCTCGCAGCATTT。

按照天根生化科技（北京）有限公司病毒基因組DNA 提取試劑盒的操作步驟說明書提取病毒DNA模板。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物在EB 濃度為0.5 μL·mL-1的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 病毒分離

PCR 檢測陽性的樣品按照每孔100 μL 接種到長滿單層MDBK 細胞的6 孔板上，37 ℃吸附1 h，傾去液體，加入維持液（含青霉素200 U·mL-1、鏈霉素200 μg·mL-1和20 mL·L-1血清的MEM 培養(yǎng)液），同時設(shè)置未接種的正常細胞做對照。在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天早、中、晚3 次觀察細胞病變（CPE），待70%細胞出現(xiàn)CPE 時收毒，于-20 ℃反復(fù)凍融3 次，收毒后再傳代3 次使病毒增殖穩(wěn)定，于-70 ℃保存。如果細胞不出現(xiàn)CPE 時，盲傳3 代，觀察細胞病變。

1.7 分離病毒株組織細胞半數(shù)感染量（TCID50）的測定

取增殖性質(zhì)穩(wěn)定的第4 代分離株病毒液100 μL用無血清的DMEM 培養(yǎng)液，在滅菌離心管中10 倍系列稀釋到10-8。在96 孔細胞培養(yǎng)板中四周各空一行，每個滴度6 個孔，每孔100 μL 稀釋的病毒液，設(shè)置一列僅加入維持液為陰性對照，然后每孔加入消化分散的MDBK 細胞懸浮100 μL，四周空白孔添加200 μL 無菌PBS，混勻后置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱觀察5 d，記錄細胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench 法計算TCID50。

1.8 病毒滅活條件的優(yōu)化

1.8.1 毒液滅活濃度和時間的篩選

每瓶病毒液中分別加入不同濃度的甲醛溶液，先用PBS 溶液（平衡液）將40%的甲醛溶液稀釋為10%的甲醛溶液。然后根據(jù)要求向病毒液中緩慢加入10%的甲醛稀釋液，混合液甲醛溶液的終濃度（V/V）分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，充分振蕩混勻后放置37 ℃恒溫箱中進行滅活。不同甲醛濃度的病毒液分別在37 ℃滅活12、24、36、48 h 后進行滅活效果檢驗。在滅活過程中，振搖病毒液數(shù)次。然后，進行無菌檢驗，確定甲醛溶液滅活的最佳濃度和時間。

1.8.2 滅活效果的檢驗

滅活后，取病毒懸液接種于單層的MDBK 細胞，加入含2%新生犢牛血清的維持液并觀察4 d。4 d 后如未觀察到細胞病變（CPE），以相同方法進行第2 代盲傳，繼續(xù)觀察4 d，如仍未見CPE 表明病毒液滅活完全。

2 結(jié)果

2.1 PCR 檢測結(jié)果

樣品細胞培養(yǎng)液的PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在362 bp 處出現(xiàn)明顯條帶，片段大小與預(yù)期相符，說明該細胞培養(yǎng)液IBR 陽性。如圖1 所示：

圖1 IBRV gB 基因序列PCR 擴增Fig.1 The glycoproteinB（gB）gene of the infectious bovine rhinotracheitis virus

2.2 病毒分離和增殖結(jié)果

病毒株盲傳一代18 h 后就出現(xiàn)細胞病變（CPE）現(xiàn)象，即細胞變圓和中間空洞的蜘蛛網(wǎng)狀。有些呈聚集成葡萄串樣，有些呈散在排列，有些卷縮成塊飄落在培養(yǎng)液中。

病毒接種24 h 后，細胞出現(xiàn)圓縮，32 h 出現(xiàn)明顯CPE，48 h 超過70%的細胞出現(xiàn)CPE（圖2），說明MDBK 細胞對于IBRV 較為敏感，可以用于病毒增殖相關(guān)試驗研究。

2.3 TCID50 檢測結(jié)果

采用Reed-Muench 法測定該分離株病毒的TCID50 為10-5.5·0.1 mL-1。

圖2 IBRV 病毒在MDBK 細胞Fig.2 IBRV virus in MDBK cells

2.4 滅活效果檢驗結(jié)果

滅活后病毒樣品接種96 孔板MDBK 細胞，分別于12、24、36、48 h 觀察細胞病變情況。結(jié)果顯示：終濃度為0.1%的甲醛溶液滅活48 h 后未滅活完全，終濃度為0.2%的甲醛滅活36 h 后滅活完全，終濃度為0.3%的甲醛滅活24 h 后滅活完全，終濃度為0.4%的甲醛滅活18 h 后滅活完全。結(jié)合TCID50 的測定結(jié)果，選擇用0.2%甲醛滅活的病毒接種未發(fā)生病變的MDBK 細胞以相同方法進行第2 代盲傳，繼續(xù)觀察4 d，仍未見CPE，效果較好。

3 討論

從20 世紀(jì)50 年代初發(fā)現(xiàn)本病至今，各大洲都有發(fā)生的報道，IBR 在全球范圍內(nèi)廣泛存在。病畜及帶毒畜為主要傳染源。牛感染該病后，在自然條件下可不定期排毒，這對該病的傳播流行起著重要的作用[5]。IBRV 在致病性方面最大的特點是其組織嗜性寬廣，除侵害呼吸系統(tǒng)外，還能侵襲多種器官和組織，引起多種臨床癥狀[6]，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失，是進口牛和精液時經(jīng)常關(guān)注的一種疫病。

根據(jù)臨床癥狀，病理變化和流行病學(xué)可作出初步診斷，但是若要確診IBRV 感染，尤其在新發(fā)生地區(qū)，必須依靠實驗室診斷方法。常用的實驗室診斷方法有：病原分離鑒定、包涵體檢查、病毒鑒定與檢測、特異性抗體的檢測（血清中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗、變態(tài)反應(yīng)）。檢測IBRV 抗原和抗體的方法很多，但存在不同程度的缺陷?；驒z測靈敏度不夠，或費時費力，或有假陽性出現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是以PCR 為基礎(chǔ)的各種檢測方法提高了檢測的敏感度和準(zhǔn)確度，縮短了檢測時間，彌補了原有的血清學(xué)檢查方法的眾多缺陷[7]。常用的分子生物學(xué)診斷方法有：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸探針法、限制性核酸內(nèi)切酶分析。

牛腎細胞對酸性環(huán)境的耐受性小，在pH 6.6～6.8的營養(yǎng)液或維持液中培養(yǎng)，易于衰老死亡，尤其初代培養(yǎng)細胞對酸性環(huán)境更為敏感，培養(yǎng)過程中應(yīng)注意pH 值的調(diào)節(jié)。細胞在有營養(yǎng)液或維持液保護的環(huán)境中，對低溫和高溫的耐受力均強，在無營養(yǎng)液保護時，對溫度特別是對低溫十分敏感，尤其是低溫溶液直接作用于細胞，可迅速引起圓縮，拉網(wǎng)，甚至完全脫落死亡[8]。

實驗中發(fā)現(xiàn)IBRV 接種于細胞單層后，前幾代往往不到24 h 就都脫落了，但隨著傳代次數(shù)的增加，病變和脫落的時間會相對穩(wěn)定在24～48 h，這是因為前幾代時病毒還不適應(yīng)細胞。等適應(yīng)后會逐漸穩(wěn)定下來，實驗中接毒后病毒在細胞上吸附的時間也很重要，吸附時間短，病毒和細胞沒有充分的結(jié)合，因而得到的病毒含量也會降低。通過實驗我們認(rèn)為接毒后吸附1.5 h，病毒才能充分與細胞相結(jié)合，這樣獲得的病毒液的病毒含量較高。

滅活方法的研究首先需確定考察指標(biāo)，然后據(jù)此選擇合理的滅活劑種類及其濃度及滅活的時間。甲醛和β-丙內(nèi)酯均常用于滅活疫苗的生產(chǎn)。甲醛滅活病毒的原理是甲醛的醛基作用于微生物的氨基產(chǎn)生經(jīng)甲基氨，作用于梭基形成亞甲基二醇單醋，作用于經(jīng)基生成經(jīng)基甲酚，作用于硫基形成亞甲基二醇，在這種情況下經(jīng)甲基代替敏感的氫原子破壞生命的基本結(jié)構(gòu)導(dǎo)致微生物死亡，但不明顯影響其免疫原性[9]。滅活病毒可用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.4%，常用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.3%，處理條件為37～39 ℃24 h 以上[10]。而β-丙內(nèi)酯（BPL）在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活，對病毒具有很強的滅活作用。直接作用于病毒核酸，保持免疫原性，強滅活效果；極易水解，無殘留，并且水解產(chǎn)物無毒無害。滅活時間短，縮短了疫苗的生產(chǎn)周期，提高了經(jīng)濟效益。但與甲醛相比，如用β-丙內(nèi)酯應(yīng)使用98%以上濃度的新試劑，β-丙內(nèi)酯保存時間過長引起自身聚合，影響滅活效果且β-丙內(nèi)酯價格明顯昂貴，不適用于發(fā)展中國家或經(jīng)濟落后國家。

病毒滅活后驗證其滅活效果應(yīng)同時考慮滅活效果和滅活方法及參數(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量的影響兩方面的驗證，應(yīng)采用最敏感的檢測方法來驗證無活病毒?？芍苯硬捎脛游锓?，觀察接種動物的存活情況，也可采用敏感細胞盲傳2 代，對每代細胞進行檢測，同時還要驗證滅活條件對疫苗抗原含量、效價等的影響。

4 結(jié)論

PCR 檢測方法特異快速的檢測出樣品為陽性，即樣品中存在牛傳染性鼻氣管炎病毒。對增殖后的牛傳染性鼻氣管炎病毒分別用0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛滅活后于12、24、36、48 h 接種于MDBK細胞觀察細胞病變情況，比較后的研究結(jié)果表明，濃度為0.2%的甲醛在37 ℃滅活36 h 對牛傳染性鼻氣管炎病毒的滅活效果最好。

［1］ 殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2 版.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］ Nandi S，Kumar M，Manohar M，et al.Bovine herpes virus infections in cattle［J］. Anim Health Res Rev，2009，10（1）：85-98.

［3］ Gibbs E P J，Rweye M M.Bovine herpesvirus［J］.Vet Bull，1977，47：317-343.

［4］ Yates W D G.A review of infectious bovine rhinotracheitis，shipping fever pneumonia and viral bacterial synergism inrespiratory disease of cattle［J］. Can J Comp，1982，46：225-263.

［5］ 陳婷. 牛傳染性鼻氣管炎病毒gD 基因原核表達及間接ELISA 檢測方法的建立［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

［6］ 李玉恒，趙明慧，趙紫陽，等.利用梯度PCR 和降落PCR擴增CIRP 基因的比較［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2011，23（5）：43-46.

［7］ 王冰. 針對gG 基因的牛傳染性鼻氣管炎病毒新型檢測方法建立和應(yīng)用［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［8］ 王延濤. 牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定及其單克隆抗體制備［D］. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2008.

［9］ 張穗.福爾馬林沉淀的簡易解聚法［J］.中國消毒學(xué)雜志，1990，7（1）：30.

［10］ 韓友圻.甲醛對細菌和病毒的殺滅作用研究進展［J］.中國消毒學(xué)雜志，1990，7（1）：31-36.