孫志遠(yuǎn)，晏磊，王彥杰，林匡飛，李輝，王偉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院）

堆肥是牛糞等農(nóng)業(yè)有機(jī)固體廢棄物最有效的無(wú)害化處理和資源化利用技術(shù)之一，堆肥化后的產(chǎn)品是有機(jī)肥，可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。糞便等廢棄物在發(fā)酵過(guò)程中存在著嚴(yán)重的氮素?fù)p失，減輕堆肥過(guò)程中氮的損失對(duì)于保護(hù)環(huán)境和提高堆肥質(zhì)量至關(guān)重要[1]。硝化作用在氮循環(huán)中起著重要的作用，首先通過(guò)氨氧化細(xì)菌的氨氧化作用將氨氧化為亞硝酸鹽，然后利用亞硝酸細(xì)菌的亞硝酸鹽氧化作用將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，其中氨氧化細(xì)菌介導(dǎo)的氨氧化是其限速步驟，主要由氨氧化細(xì)菌（AOB）的細(xì)菌來(lái)完成氨的氧化過(guò)程[2]。

隨著氨氧化關(guān)鍵功能基因—氨單加氧酶功能基因（amoA）在泉古菌（Crenarchaeota）中的發(fā)現(xiàn)，研究者們發(fā)現(xiàn)在海洋[3-5]、土壤[6-10]、淡水沉積物[11-12]、陸地?zé)崛猍13-17]，生物反應(yīng)器[18-19]、河口沉積物[20-22]、地下水[23-25]、水族館[26]、冰川[27]等環(huán)境中的氨氧化過(guò)程都有氨氧化古菌（AOA）的蹤跡。氨氧化古菌的廣泛發(fā)現(xiàn)使人們改變了對(duì)氮循環(huán)的認(rèn)識(shí)，因此，研究堆肥環(huán)境中AOB和AOA 的種類特征對(duì)于理解堆肥中的氮元素循環(huán)有著積極的作用，它們可能在堆肥環(huán)境中的氮循環(huán)中發(fā)揮著作用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用分子生態(tài)學(xué)方法以16S rRNA 基因或amoA 基因?yàn)闃?biāo)記，對(duì)堆肥過(guò)程中AOB和AOA 種群特征和系統(tǒng)發(fā)育狀況進(jìn)行分析研究[28-29]。研究采用克隆技術(shù)對(duì)一牛糞為原料的條垛式堆肥高溫期的AOB 和AOA 群落結(jié)構(gòu)的進(jìn)行分析，通過(guò)研究AOA 和AOB 的生物多樣性及系統(tǒng)發(fā)育，希望為堆肥中氮循環(huán)研究提供理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 堆肥原料

堆肥樣品采自哈爾濱菁菁堆肥廠，原料為新鮮牛糞和秸稈。將牛糞與秸稈按體積比1∶1 混合，調(diào)節(jié)含水量60%～65%。每4 d 翻堆1 次。樣品采自堆肥化過(guò)程中的高溫期（第10 d）。各項(xiàng)理化參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 堆肥樣品理化參數(shù)Table 1 Physico-chemical features of compost sample

1.2 堆肥樣品的采集，DNA 提取及純化

于堆肥高溫期從堆體上、中、下3 層5 個(gè)位置取樣，充分混合均勻，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量樣品溫度及其他各項(xiàng)理化參數(shù)，將樣品置于在-20 ℃冰箱保存。采用氯苯法[30]對(duì)樣品進(jìn)行DNA 的提取，用DNA 凝膠純化試劑盒（TaKaRa）純化DNA。

1.3 amoA基因的擴(kuò)增

利用引物對(duì)amoA-1F∶5′-GGGGTTTCTACTGGT GGT-3′和amoA-2R∶

5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′進(jìn)行AOB amoA 基因的擴(kuò)增[31]。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，60 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

利用引物對(duì)Arch-amoAF∶5′-STAATGGTCTGGC TTAGACG-3′和Arch-amoAR∶

5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′進(jìn) 行AOA amoA 基因的擴(kuò)增[32]。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用DNA 純化試劑盒Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（TaKaRa）進(jìn)行純化。

1.4 克隆文庫(kù)構(gòu)建和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將純化后PCR 產(chǎn)物，與pGEM-Teasy 載體（Promega，Madison，WI）在4 ℃條件下進(jìn)行連接，連接時(shí)間為16 h，將連接好的載體轉(zhuǎn)化入DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。分別從涂有X-gal 和IPTG 的氨芐霉素的兩個(gè)LB 平板上（AOA，AOB）隨機(jī)挑取50 個(gè)克隆子采用特異引物M13-47 和RV-M 的PCR 擴(kuò)增進(jìn)行陽(yáng)性古菌克隆子的篩選，最終將其中經(jīng)鑒定為陽(yáng)性克隆子的30 個(gè)克隆子送上海生工測(cè)序，將其序列用mouth 軟件按相似度97%對(duì)AOA、AOB 序列進(jìn)行劃分，各分為5 個(gè)OTU，從每個(gè)OTU 中選出一條序列與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取相似度最高的同源序列作為參照序列，與研究代表序列結(jié)合在一起。然后，通過(guò)Bioedit 軟件包中的Clustal W，將序列對(duì)齊，并將對(duì)齊后的序列文件轉(zhuǎn)為MEGA4.0 軟件的文件輸入格式。最后，用MEGA4.0 軟件做系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥樣品總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增

采用氯苯法提取的DNA 條帶較為清晰。AOA 與AOB amoA 基因的PCR 擴(kuò)增采用DNA 原液稀釋的方法進(jìn)行DNA 樣品PCR 擴(kuò)增，濃度稀釋在10～50 倍之間可達(dá)到較理想的擴(kuò)增效果。試驗(yàn)將DNA 原液稀釋20 倍為模板，擴(kuò)增堆肥樣品AOB 和AOA amoA基因。結(jié)果分別得到490 bp 和610 bp 大小的條帶（圖1 和圖2）。

圖1 氨氧化細(xì)菌（AOB）PCR 產(chǎn)物Fig.1 Ammonia-oxidizing bacteria（AOB）PCR products

2.2 AOB 種群構(gòu)成及多樣性

研究氧化細(xì)菌的amoA 功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的引物均屬于β-Proteobacteria，分別為亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）分支和亞硝化螺菌（Nitrosospira）分支，2 個(gè)分支未找到相似的已知菌種amoA 功能基因序列。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，Nitrosospira Cluster 序列與主要來(lái)自于耕作土壤、湖泊底泥、熱泉、生物反應(yīng)器的amoA 基因序列聚集在同一分支上，其中CCS-4序列與Uncultured Nitrosomonas sp. clone AOB-R4-1（HQ230333） 的 同 源 性 為87% 。 這 與Nozomi Yamamoto[28]發(fā)現(xiàn)的amoA 基因序列相似，可能為一種新的氨氧化細(xì)菌。Nitrosomonas Cluster 主要與來(lái)自土壤、生物反應(yīng)器的amoA 基因序列聚集在同一分支上，種群結(jié)構(gòu)相對(duì)單一（圖3）。

圖2 氨氧化古菌（AOA）PCR 產(chǎn)物Fig. 2 Ammonia-oxidizing Archaea（AOA）PCR products

圖3 基于amoA 基因構(gòu)建的堆肥高溫期樣品的氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees of ammonia-oxidizing bacteria（AOB）targeted on amoA gene

2.3 AOA 種群構(gòu)成及多樣性

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看（圖4）研究AOA amoA 基因系統(tǒng)發(fā)育較為單一，克隆序列都屬于未培養(yǎng)的Crenarchaeota（泉古菌門）。通過(guò)amoA 功能基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)檢測(cè)到的AOA 與已知AOA 并不聚類到一個(gè)分支上，其中CCS6、7、9、10 所代表的OTU 克隆序列在研究樣品中AOA 基因文庫(kù)中占94.2%，與來(lái)自土壤、熱泉、生物反應(yīng)器，湖泊沉積物的AOA amoA 基因序列聚集在同一分支上；而與海洋沉積物的AOA amoA 基因序列相似性較高的僅有CCS-8 序列所代表的一個(gè)OTU。

圖4 基于amoA 基因構(gòu)建的堆肥高溫期樣品的氨氧化古菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic trees of ammonia-oxidizing archaea（AOA）targeted on amoA gene

3 討論

AOB 是一類化能自養(yǎng)型的微生物，廣泛分布于各種自然環(huán)境中。在伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版中將其分為5 個(gè)屬：亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝 化 螺 菌 （Nitrosospira）、 亞 硝 化 葉 菌 屬（Nitrosolobus）、亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化球菌（Nitrosococcus）。研究利用AOB amoA 功能基因檢測(cè)到Nitrosospira 和Nitrosomonas，Nitrosomonas克隆子占整個(gè)克隆文庫(kù)的59.3%，Nitrosospira 為40.7%。從進(jìn)化樹(shù)看研究的AOB 基因序列與分布在淡水沉積物、干旱土壤、蔬菜土壤、生物反應(yīng)器等環(huán)境中的序列有很大的相似度，這與虞泳[33]和Shimaya[34]等以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料的堆肥化過(guò)程中Nitrosospira 和Nitrosomonas 為堆肥中AOB 的優(yōu)勢(shì)種屬的研究結(jié)果一致。Nitrosomonas 是耐受性較強(qiáng)的種屬，存在于整個(gè)堆肥過(guò)程中。Chikako Shimaya 和Tomoyoshi Hashimoto 在50 ℃高溫條件下成功富集培養(yǎng)了堆肥中的嗜熱AOB，隨著培養(yǎng)條件的不斷成熟，人工培養(yǎng)的AOB 可能很快就會(huì)在實(shí)際的堆肥生產(chǎn)中發(fā)揮除氨固氮作用。

氨氧化古菌（AOA）在氮素循環(huán)中的重要作用是最近幾年才被發(fā)現(xiàn)的，它們是一類以重碳酸鹽為碳源、利用銨態(tài)氮氧化產(chǎn)生細(xì)胞能量進(jìn)行化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)生長(zhǎng)的獨(dú)立于AOB 進(jìn)化分支外的進(jìn)化類群，屬于泉古菌門（Crenarchaeota）。AOA 不僅廣泛存在于自然界中，并且在菌體數(shù)量上也大大超過(guò)了AOB[35]，有報(bào)道在牛糞堆肥過(guò)程中古菌的數(shù)量大于AOB[28]。研究在高溫好氧堆肥中同樣證實(shí)了AOA 的存在，所獲得的AOA amoA 基因序列都屬于泉古菌門（Crenarcharota），AOA 群落結(jié)構(gòu)比較單一，與土壤的同源性高的AOA 占大多數(shù)，與海水及海洋沉積物中的AOA 的amoA 基因序列相似性很低，這表明堆肥環(huán)境中AOA 與土壤中AOA 可能有著相似近緣關(guān)系。由于數(shù)量與功能之間不一定是絕對(duì)相關(guān)，因此，AOA 與AOB 在堆肥環(huán)境氮循環(huán)中的哪個(gè)更起到主要作用還需要通過(guò)活性檢測(cè)，但是由于AOA 的不可培養(yǎng)性限制了相關(guān)研究。

當(dāng)然只根據(jù)所得到的序列還不足以說(shuō)明AOB、AOA 與堆肥環(huán)境因子之間的響應(yīng)關(guān)系，尤其是AOA與AOB 哪種菌群在堆肥環(huán)境中對(duì)氮循環(huán)作用更大一些。研究發(fā)現(xiàn)溫度是影響硝化細(xì)菌的關(guān)鍵因子[36-37]，并可能是影響硝化古菌的重要環(huán)境條件，嗜熱AOA 對(duì)溫度的變化具有很高的耐受能力，它們能夠活躍在38～97 ℃的溫泉、地礦等受地?zé)嵊绊懙沫h(huán)境中[38-40]。由于研究樣品采自堆肥高溫期，因此溫度可能是造成這種現(xiàn)象的因素，該AOA 菌群應(yīng)屬于嗜熱AOA 菌群。AOA 在堆肥環(huán)境中的發(fā)現(xiàn)拓寬了人們研究堆肥環(huán)境中氮循環(huán)的思路，為堆肥中的氮循環(huán)提供了新的研究方向。

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