單玉興，張海玉，王立君，萬法青，盧良杰

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部第一醫(yī)院1.骨科；2.兒外科，吉林 長春130021）

藤黃酸（gambogic acid，GA）為新型抗腫瘤藥物，對正常組織細(xì)胞無副作用，是很有發(fā)展前景的抗腫瘤藥物［1］。端粒酶在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生，發(fā)展中所起的作用已被認(rèn)可。90%以上的腫瘤細(xì)胞都具有較高的端粒酶活性，而多數(shù)的體細(xì)胞則缺少端粒酶活性［2］。端粒酶以自身的R N A為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒D N A重復(fù)序列并添加到端粒末端，以補(bǔ)償因細(xì)胞每次分裂而丟失的末端堿基，保證染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性，為腫瘤細(xì)胞的永生化提供了條件。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是端粒酶的限速成分，hTERT基因的表達(dá)調(diào)控對端粒酶表達(dá)活性調(diào)節(jié)起決定性作用，Bcl－2基因（即B細(xì)胞淋巴瘤／白血?。?基因）是一種原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。hTERT和Bcl－2蛋白都是很好的腫瘤治療靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過研究GA對骨肉瘤細(xì)胞中hTERT和Bcl－2蛋白的影響，為GA治療骨肉瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞株（HOS和CCK8）購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。GA購于北京易萊西諾生物科技有限公司。主要試劑：胎牛血清（HyClone）購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司。hTERT抗體購于Santa Cruz公司；Bcl－2抗體，DAB顯色試劑盒，免疫組化染色試劑盒（SP試劑盒）均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和100μ／ml雙抗的高糖DMEM（含酚紅）。

1.2.2 CCK－8法檢測細(xì)胞增殖狀況 將細(xì)胞種植于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，每孔分別加入終濃度為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8 μmol／L，含有 GA的培養(yǎng)基200μl，同時(shí)設(shè)一不加藥物組，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，72h，96 h，120h后每孔加入CCK－8溶液20μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光值；在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相。以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）計(jì)算公式為：SF（%）＝（實(shí)驗(yàn)組 OD值／對照組 OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，最后以3個(gè)平行樣品的SF均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）繪制時(shí)間－存活曲線。

1.2.3 免疫組化檢測hTERT和Bcl－2蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)平行樣，同時(shí)設(shè)立對照組。培養(yǎng)24h后，每孔加入含有最適濃度GA培養(yǎng)基1 ml，培養(yǎng)3d，5d。采用鏈霉素親生物素－過氧化酶聯(lián)接法（SP法）。常規(guī)固定，染色，10倍倒置顯微鏡下，選取具有適當(dāng)形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞照相。應(yīng)用Image J軟件和Image Pro Plus軟件對免疫組化圖像進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用配對卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 GA作用后細(xì)胞存活 細(xì)胞存活曲線描述了不同藥物劑量在不同時(shí)間骨肉瘤細(xì)胞存活情況。見圖1。

骨肉瘤HOS細(xì)胞的存活率隨著時(shí)間的推移明顯降低，而且未見明顯的后期細(xì)胞增殖。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，細(xì)胞的存活率與藥物劑量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

2.2 hTERT和Bcl－2蛋白檢測 應(yīng)用Image Pro Plus軟件對免疫組化圖像分析表明各圖像灰度值逐漸增強(qiáng)，說明各圖像蛋白含量逐漸減低。數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)組的hTERT和Bcl－2蛋白表達(dá)明顯低于對照組，且表達(dá)強(qiáng)度明顯與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。（見表1）。

圖1 凋亡率與時(shí)間、藥物劑量之間的關(guān)系

表1 免疫組化圖像灰度值分析

應(yīng)用Image J軟件對免疫組化圖像進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽性細(xì)胞越多，說明表達(dá)hTERT和Bcl－2蛋白的細(xì)胞越多，也就意味著表達(dá)hTERT和Bcl－2蛋白的細(xì)胞分布之廣，反之亦然。經(jīng)配對卡方檢驗(yàn)，差異有顯著性（P＜0.05）.（見表2）

表2 免疫組化圖像陽性細(xì)胞數(shù)分析

2.3 hTERT和Bcl－2蛋白表達(dá)的關(guān)系 通過配對卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)hTERT和Bcl－2蛋白的表達(dá)具有高度的一致性，兩者表達(dá)具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在了解hTERT與Bcl－2蛋白的諸多行為關(guān)系的基礎(chǔ)上，旨在了GA對骨肉瘤（HOS）中hTERT和Bcl－2蛋白的影響及可能相關(guān)性，同時(shí)為GA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

骨肉瘤（成骨肉瘤）是最常見的惡性骨腫瘤。發(fā)病率很高，典型骨肉瘤一般見于10－20歲年齡段，但在任何年齡段都可發(fā)生，包括嬰幼兒，兒童以及老年人。男性發(fā)病率較高，男女之比約2∶1。具有很強(qiáng)的局部浸潤能力和肺轉(zhuǎn)移能力。手術(shù)治療已大大提高了患者的預(yù)后，但有很高的致殘率。

常規(guī)化療副作用大，且預(yù)后較差。GA為抗腫瘤一類新藥，已進(jìn)入臨床研究。目前研究表明GA在有效劑量范圍內(nèi)毒副作用比較小，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區(qū)別，能選擇性的殺死癌細(xì)胞，而對正常組織細(xì)胞無明顯影響，有很好的發(fā)展前景。

端粒酶在90%的癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)很少，是公認(rèn)的抗癌靶點(diǎn)，可反映化療的效果［3］。而端粒酶活性受hTERT 的調(diào)控［4，5］，是端粒酶的限速酶［6］，與端粒酶活性具有平行關(guān)系［7，8］。目前很多學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向hTERT，希望能夠有所突破［9］。Bcl－2基因是大家關(guān)注熱點(diǎn)，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道Bcl－2蛋白可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，同時(shí)提高h(yuǎn)TERT 的表達(dá)［10－12］，但是也有實(shí)驗(yàn)證實(shí) Bcl－2蛋白與hTERT 無相關(guān)，甚至負(fù)相關(guān)［13，14］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未經(jīng)處理的骨肉瘤細(xì)胞在光鏡下觀察主要為短梭形，細(xì)胞排列緊密，核大，核分裂多見，細(xì)胞密集時(shí)呈多層生長。經(jīng)GA處理后，細(xì)胞形態(tài)變成以多角形為主，單層排列，細(xì)胞大小趨向均一，核小而深染，提示形態(tài)上出現(xiàn)分化改變。隨著藥物濃度的增高，骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增大；隨著藥物作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的凋亡率也明顯增大。在最適濃度的作用下，以時(shí)間為軸線，在對照組中，hTERT和Bcl－2蛋白的表達(dá)無明顯變化；在實(shí)驗(yàn)組（3d），實(shí)驗(yàn)組（5d）中，hTERT和Bcl－2蛋白的表達(dá)在逐漸減弱，與藥物作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，與相關(guān)報(bào)道一致［15，16］；二者與藥物存在時(shí)間依賴關(guān)系，在表達(dá)上呈高度一致性。

GA、hTERT存在時(shí)間依賴關(guān)系，但是并不確定GA是否直接影響端粒酶活性；Bcl－2蛋白與hTERT存在高度一致性，二者之間是否存在互相協(xié)助的作用，有待進(jìn)一步研究；因部分正常組織中存在端粒酶活性，所以GA對其有無副作用，同樣有待進(jìn)一步研究；hTERT和Bcl－2基因蛋白的表達(dá)的測定是半定量的，還存在某些假陽性和假陰性的可能；腫瘤細(xì)胞內(nèi)為低PH狀態(tài)［17］，但本實(shí)驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞是在pH7.2－7.4狀態(tài)下進(jìn)行的，這不能反映體內(nèi)惡性腫瘤組織的低PH狀態(tài)。以上問題有待進(jìn)一步論證。

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