劉春玲，焦慧娟，許美娟，丁志青，李宏全，姜俊兵

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱為豬藍(lán)耳病，該病由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，屬套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬。發(fā)病豬主要表現(xiàn)為發(fā)熱，出現(xiàn)不同程度的呼吸系統(tǒng)癥狀，豬群免疫功能下降，易繼發(fā)感染其他細(xì)菌性和病毒性疾病，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬抗菌肽（Protegrin－1）最初從豬白細(xì)胞中分離得到。PG－1僅在豬體內(nèi)表達(dá)，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌具有抗菌作用，可降低慢病毒亞科的傳染性和抗囊膜病毒感染。PG－1基因一般在豬的骨髓細(xì)胞中表達(dá)，以無活性的形式存在于嗜中性粒細(xì)胞的分泌性顆粒中，在其mRNA的5＇端有自身的信號肽編碼序列，翻譯后指導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞中PG－1的分泌，只有PG－1成熟的C－末端部分經(jīng)嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶裂解后才具有抗微生物的活性［1］。發(fā)生感染時，細(xì)胞因子引起嗜中性粒細(xì)胞向感染位置移行，分泌的PG－1等抗菌肽可增強天然免疫反應(yīng)，并使組織損傷降低到最小程度。Lisanby等人的研究發(fā)現(xiàn)，PG－1與其他AMPs具有最高的協(xié)同抗微生物作用［2］。PG－1廣譜的抗菌活性已經(jīng)得到了證實，但PG－1和豬繁殖與呼吸綜合征病毒有何相互影響未見報道，本研究為揭示PRRSV對豬自身抗菌肽基因表達(dá)的影響，測定了豬肺臟和小腸中PG－1基因在PRRSV攻毒和對照組的mRNA表達(dá)，研究的結(jié)果為進(jìn)一步揭示PRRSV對肺臟組織侵害的分子機理提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物動物模型的建立 隨機挑選6頭20日齡斷奶健康仔豬（購自山西天祿豐種豬育種有限公司養(yǎng)豬場），體重為7.5±1.0kg，室溫飼養(yǎng)，多維飼料飼喂，自由飲水。進(jìn)行血液檢測，通過豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA試劑盒和檢測試紙檢測血液，抗原結(jié)果均為陰性。分圈飼養(yǎng)，每個圈3頭，為正常對照組和PRRSV攻毒組，飼養(yǎng)一周后進(jìn)行攻毒。依據(jù)相關(guān)研究的報道［3－5］，我們將攻毒的劑量定為104.0TCID50，口服4mL，肌肉注射2mL，隔天攻毒1次，連續(xù)攻毒3次，攻完毒的第7天（仔豬34日齡），取肺臟和小腸組織。試驗所用的PRRSV由江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈送。

1.2 感染過程血液中病毒的鑒定 病毒攻毒期間，攻毒2、4、7、9d采血提取血液中的RNA鑒定攻毒是否成功。提取后通過用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測豬血細(xì)胞總RNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。攻毒第4天，采血后進(jìn)行PCR，病毒組電泳后有條帶，證明血液中已有PRRSV感染。PCR產(chǎn)物在196bp左右，經(jīng)公司測序鑒定產(chǎn)物為PRRSV編碼區(qū)DNA片段，表明豬體內(nèi)含有PRRSV。

1.3 病理組織學(xué)檢查 肺部樣品經(jīng)固定制成鏡檢肺部病理切片，做H.E.染色后對切片用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4 肺組織總RNA的提取與合成cDNA 采樣時（34日齡）取肺和小腸組織樣品包在錫箔紙中投入液氮保存。取1g組織樣品按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。獲得的總RNA經(jīng)濃度測定和凝膠電泳檢測后用于反轉(zhuǎn)錄cDNA。首先將RNA濃度歸為同一濃度，反轉(zhuǎn)錄體系為：RNA 1 μL、Oligo dT 1μL、Buffer 4μL、Enzyme mix 1 1 μL、Oligo dT 1μL，用DEPC水處理的ddH2O補至20μL。反應(yīng)程序為：37℃30min，85℃5s，產(chǎn)物置－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.5.1 PG－1基因部分片段的擴(kuò)增與克隆 利用Primer 3.0軟件設(shè)計PG－1 基因（HM371181.1）克隆引物，上游引物：5′－TAGGTTCTGCGTCTGTGTCG－3′，下游引物：5′－AGGTCTCCTTGCTGGGATTT－3′，擴(kuò)增長度為220bp。再設(shè)計得到PG－1熒光定量PCR的特異性引物：上游引物：5′－CGGTTGCGACGGCAGGCTTT－3′，下游引物：5′－ATGGTGCGGGCCGGAAAGGT－3′，擴(kuò)增長度94bp。熒光定量引物的擴(kuò)增產(chǎn)物位于以上克隆片段內(nèi)，均由北京優(yōu)博基因科技有限公司合成。

20μL PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2μL，2.5 mmol／L dNTP 2μL，5pmmol／L上游和下游引物各1μL，Taq酶0.2μL，cDNA 模板1μL，ddH2O 12.8μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min→94℃1min→58℃30s→72℃1min，共30個循環(huán)；72℃延伸8min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將純化后產(chǎn)物與pMD18載體連接，轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，按E.Z.A.TM Plasmid試劑盒的使用說明，提取質(zhì)粒。

1.5.2 測濃度計算質(zhì)?？截悢?shù) 由于使用的是小量質(zhì)粒提取試劑盒，提出來的質(zhì)粒濃度比較低，采用真空泵，濃縮溶液至60μL。采用核酸測定儀（Biophotometer Plus，Eppendorf）測定質(zhì)粒濃度后，按以下公式計算質(zhì)?？截悢?shù)：

質(zhì)粒拷貝數(shù)（copies／μL）＝6.02×1023（copies／mol）×質(zhì)粒濃度（g／μL）／質(zhì)粒分子量（g／mol）；

測得PG－1質(zhì)粒拷貝數(shù)為3.8×1010copies／μL。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 （1）將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用ddH2O進(jìn)行10倍系列稀釋，分別稀釋成1×1010至1×105copies／μL的6個梯度為模板進(jìn)行熒光絕對定量PCR；（2）熒光定量PCR體系：模板1μL，熒光定量PCR上、游引物各0.5μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃30min；95℃10s→60℃30s→72℃30s，40個循環(huán)；72℃5min；生成溶解曲線步驟：55℃30 s，每30s升溫0.5℃，81個循環(huán)。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

2 結(jié)果

2.1 攻毒后臨床癥狀及病理變化 攻毒前后對每頭豬進(jìn)行體溫檢測。攻毒5d，病毒組3頭豬中有1頭有神經(jīng)癥狀出現(xiàn)，全身顫抖，攻毒6d，病毒組3頭豬食欲不振，喜臥，都有顫抖癥狀。攻毒9d，全組進(jìn)食基本廢絕，喜臥，顫抖。對每頭豬進(jìn)行體溫檢測，結(jié)果如表1所示，攻毒組在攻毒后體溫顯著高于空白組（P＜0.05）。

攻毒10d，采樣，剖檢觀察病理變化。病毒組3頭豬剖檢后發(fā)現(xiàn)肺部石變，間質(zhì)性肺炎，肺小葉間質(zhì)增寬，肺充血并有氣腫。脾臟、腹股溝淋巴結(jié)腫大。腎表面有出血點及白色點狀。

表1 攻毒組與空白對照組體溫

2.2 病理切片分析結(jié)果 如中插彩版圖1所示，病理切片鏡檢發(fā)現(xiàn)攻毒組的肺間質(zhì)增寬，肺泡被破壞或代償性擴(kuò)張。脾臟紅髓區(qū)脾索溶解，脾竇擴(kuò)大。這些現(xiàn)象符合PRRSV感染豬肺后的病理變化。

2.3 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過Real－time PCR儀擴(kuò)增，自動檢測出PG－1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線（圖2）。

圖2中的圓點為10倍梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，交叉符號為未知的測定樣品。未知樣品中PG－1基因的拷貝數(shù)主要集中在104～106之間。曲線方程為：Y＝3.324 X＋40，決定系數(shù)為：R2＝0.994，曲線的擴(kuò)增效率為：E＝99.9%。這說明在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖2 豬PG－1 基因Real－time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 PG－1基因在肺臟和小腸中的表達(dá) 圖3所示PG－1基因在肺臟和小腸兩個組織中的表達(dá)。攻毒組PG－1基因的表達(dá)量在這兩種組織中都比未經(jīng)PRRSV攻毒的對照組攻毒與對照組低。在小腸中，攻毒組PG－1基因的表達(dá)量（1.06×105拷貝）低于在對照組中的表達(dá)量（1.72×105拷貝），但二者的差異不顯著。在肺臟中，攻毒組PG－1基因的表達(dá)量（1.28×105拷貝）顯著低于在對照組中的表達(dá)量（3.48×105拷貝），即PRRSV攻毒會顯著降低豬肺臟中PG－1的表達(dá)。

圖3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染影響PG－1基因在肺臟和小腸組織中的絕對表達(dá)量

3 討論

PG－1是抗菌肽（Protegrins－1）中5位成員之一，它的表達(dá)是在骨髓細(xì)胞分化的過程中進(jìn)行的，因此在成熟的嗜中性粒細(xì)胞中很難找到它們的mRNA。編碼的Protegrins在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞，然后信號肽切除，剩下的部分叫做Proform或者Propeptide。無活性的Propeptide貯存在嗜中性粒細(xì)胞中，并隨血流到達(dá)身體的各個部位，當(dāng)動物受到病原微生物刺激或者急性感染時，Protegrins在彈性蛋白酶的作用下，活性的PG就分泌出細(xì)胞并發(fā)揮免疫作用?？咕闹饕谪i的骨髓干細(xì)胞中表達(dá)合成［6］，在肺臟和小腸中GP－1基因的表達(dá)尚未見報道。Cheung等人報道了轉(zhuǎn)PG－1基因鼠在肺臟中PG－1基因的表達(dá)研究。該研究分析了野生型小鼠的肺臟中沒有檢測到PG－1基因的表達(dá)［7］。在肺臟和小腸中GP－1基因的表達(dá)尚未見報道，我們通過常規(guī)的基因克隆技術(shù)，成功獲得了豬抗菌肽PG－1基因中的特定片段熒光定量PCR的方法，證明PG－1基因在豬的肺臟和小腸組織中均有表達(dá)，但不明確該基因在肺臟的何種細(xì)胞中表達(dá)。

近年來關(guān)于PRRSV攻毒的對機體的損害機理及和相關(guān)基因表達(dá)影響的研究較為深入。Calzada等的研究都證明，PRRSV感染可以抑制IFN基因的表達(dá)導(dǎo)致IFN－α蛋白減少［8－9］；Brockmeier等 人應(yīng)用腺病毒載體在豬肺臟中表達(dá)干擾素alpha基因可減輕豬受到PRRSV攻毒的損害［10］；相關(guān)研究證明，在肺泡巨噬細(xì)胞中Toll樣受體3和干擾素Beta的表達(dá)可以抑制PRRSV的感染［11］。Sang等人對抗菌肽在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染時表達(dá)變化的研究表明，在MARC－145細(xì)胞中PG－4基因的表達(dá)可以顯著的抑制病毒的感染［13］，PG－1具有很強的抗細(xì)菌活性和中度的抗病毒活性［14］。這些研究均說明PRRSV感染將影響多種相關(guān)基因的表達(dá)。本研究在測定了該基因在豬感染了PRRSV后，肺臟和小腸組織中的表達(dá)量，分析得出PG－1基因在肺臟、小腸組織中有表達(dá)，與對照組比較，PRRSV攻毒會顯著降低肺臟中PG－1的表達(dá)，而對小腸組織中的表達(dá)無顯著影響。試驗證明豬感染PRRSV后，肺臟中抗菌肽PG－1的表達(dá)受到了顯著抑制，以致免疫防御能力降低，但具體的作用機制需進(jìn)一步的探究。

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