王國(guó)超，王滬生，喬 軍，孟慶玲，劉昱成，楊海波，賀志昊，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子832003；2.新疆沙灣縣獸醫(yī)站，新疆 沙灣832002）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬 （Pestivirus）成員，屬內(nèi)同時(shí)還包括豬瘟病毒（CSFV）、綿羊邊界病病毒（BDV）。BVDV主要引起牛的以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細(xì)胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病。目前，該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家更為嚴(yán)重。新生牛的持續(xù)性感染常年帶毒、排毒，是畜群中主要的傳染源。當(dāng)持續(xù)感染動(dòng)物再次感染抗原性相關(guān)的BVDV時(shí)可會(huì)引起致死性的黏膜?。?］。同時(shí)，BVDV還是牛源生物制品（血清、凍精、胚胎、疫苗等）的潛在污染源，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2－3］。

BVDV基因組為單股正鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為12.3kb，5′端無(wú)“帽子”結(jié)構(gòu)，3′端無(wú)Poly（A）“尾巴”結(jié)構(gòu)，病毒基因組由 5′－UTR、開(kāi)放閱讀框（ORF）和3′－UTR組成［4］。5′－UTR 序列在 BVDV基因組中有較高的保守性，利用此特性可對(duì)BVDV的感染進(jìn)行分子診斷和病原基因分型。目前通常認(rèn)為，根據(jù)其5′－UTR是否存在Pst1位點(diǎn)BVDV可分為兩種基因型，即BVDV－1和BVDV－2，不同的基因型在抗原性上存在較大差異［4］。根據(jù)其接種細(xì)胞后是否產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），又可以將其分為兩種生物型，即致細(xì)胞病變型（CP）和非致細(xì)胞病變型（NCP），每種基因型同時(shí)存在這兩種生物型，兩種生物型在毒力和致病性方面沒(méi)有明顯差別［5］。為了了解在新疆是否同時(shí)存在BVDV－1和BVDV－2的感染，本研究對(duì)2012年采集沙灣縣某牛場(chǎng)疑似BVDV感染牛的病料進(jìn)行了BVDV的檢測(cè)和分離。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、毒株及試劑 MDBK 細(xì)胞、BVDV NADL標(biāo)準(zhǔn)毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。宿主菌E.coli DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD19－T載體、反轉(zhuǎn)錄酶 M－MLV及RNA抑制劑，購(gòu)自TaKaRa公司。1640高糖培養(yǎng)基、犢牛血清（經(jīng)過(guò)BVDV檢測(cè)陰性），購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；TRIzol Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司；DNA回收試劑盒、DNA Marker、dNTP和Taq酶，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 病料采集 從新疆沙灣縣周邊某牛場(chǎng)采集臨床癥狀疑似BVDV感染牛的血液、糞便、腸黏膜、淋巴結(jié)、脾臟等病料15份，置于－80℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的BVDV 5′－UTR序列和E2基因序列選擇相對(duì)保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，其中P1－P2用于篩查疑似病料是否為BVDV陽(yáng)性，P3－P4和P5－P6分別用于BVDV基因1型和基因2型E2基因的擴(kuò)增。引物及測(cè)序服務(wù)由北京華大基因公司完成。P1：5′－CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT－3′；P2：5′－GGAACTCCATGTGCCATGTACA－3′。E2基因引 物 P3：5′－GGGCCAGCCTTCCAGATGGT－3′；P4：5′－TCCCCCTTTAACATGTATTG－3′。 P5：5′－GGGCCAGCCTTCCAGATGGT 3′；P6：5′－TCCCCCTTTAACATGTATTG－3′。

1.4 RT－PCR擴(kuò)增及5′－UTR的克隆 參照 TRIzol說(shuō)明操作提取病料總RNA，以提取的RNA為模板進(jìn)行RT反應(yīng)，再以RT產(chǎn)物為模板進(jìn)行5′－UTR PCR檢測(cè)。RT反應(yīng)采用20μL反應(yīng)體系：M－MLV 5 ×Buffer 5μL，dNTP（2.5μmol／L）4 μL，下游引物（20pm）1μL，RNase inhibition 1μL，M－MLV reverse enzyme 1μL，RNA－free Water 8 μL，20μL體系，混勻37℃反轉(zhuǎn)錄1h。以RT產(chǎn)物為模板，采用50μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×Buffer 5μL，cDNA 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq酶0.5μL，H2O 33.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性50s，58℃退火40s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增用DNA凝膠回收試劑盒回收后與載體pMD19－T連接，通過(guò)PCR和酶切進(jìn)一步篩選驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。將鑒定正確的重組載體送北京華大基因公司測(cè)序；用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序進(jìn)行分析。

1.5 病毒的分離鑒定

1.5.1 樣品的處理 對(duì)于RT－PCR檢測(cè)陽(yáng)性的組織病料，加入4體積的PBS緩沖液研磨，以12 000 r／min（4℃）離心15min。吸取上清液，按0.1%體積加入雙抗，混勻在4℃作用過(guò)夜，12 000r／min（4℃）離心15min吸取上清，0.22μm濾膜過(guò)濾，－80℃保存用于病毒的分離。對(duì)于RT－PCR檢測(cè)陽(yáng)性的血液樣品用淋巴細(xì)胞分離液無(wú)菌分離外周血單核細(xì)胞（PBMC），吸取后置于1640培養(yǎng)液中待用。

1.5.2 病毒分離 將長(zhǎng)成單層的MDBK細(xì)胞用PBS沖洗3遍，將處理好的病料上清液或PBMC接種MDBK單層細(xì)胞，置于37℃、5%CO2吸附2h，然后加入1640細(xì)胞維持液（含2%犢牛血清），每日觀察細(xì)胞3次，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞和接種NADL毒株細(xì)胞作對(duì)照。連續(xù)盲傳5代，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。待出現(xiàn)CPE時(shí)，反復(fù)凍融3次后，培養(yǎng)液用2%磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀察。

1.5.3 BVDV－SW 分離株 E2基因的擴(kuò)增、克隆、遺傳進(jìn)化分析 用TRIzol提取BVDV－SW 株總RNA，分別用BVDV基因1型和基因2型E2基因特異性引物P3－P4和P5－P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，52℃退火50s，72℃延伸90s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將擴(kuò)增出來(lái)的目的片段回收后與pMD19－T載體連接，轉(zhuǎn)化克隆后挑取單菌落，做菌液PCR篩選，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序分析。用MEGA5.0軟件（Phylogeny／Bootstrap test of phylogeny／neighbor－joining，Bootstrap 重 復(fù) 次 數(shù) 為1 000次）構(gòu)建E2基因的遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病料檢測(cè)結(jié)果 利用5′－UTR引物對(duì)15份病料進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果有4份樣品（其中2份為糞便樣品，2份為血液樣品）擴(kuò)增出與預(yù)期值相符的293bp的目的片段（圖1）。目的片段克隆入T載體后，用PCR方法篩選重組菌（圖2）并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果從樣品擴(kuò)增出的5′－UTR 與 BVDV－2 5′－UTR同源性為99.2%，證實(shí)疑似病料確實(shí)屬于BVDV感染。

圖1 5′UTR PCR擴(kuò)增

圖2 陽(yáng)性重組菌液的PCR鑒定

2.2 病毒分離結(jié)果 當(dāng)盲傳傳至第4代時(shí)，MDBK出現(xiàn)規(guī)律性的細(xì)胞病變（CPE）（圖3），主要表現(xiàn)為：梭狀或三角狀細(xì)胞開(kāi)始變圓，部分細(xì)胞開(kāi)始脫落，漂浮在維持液中；在瓶壁上呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀，胞漿中出現(xiàn)大小不等的空泡，細(xì)胞碎片漂浮在液面上。在產(chǎn)生細(xì)胞病變的培養(yǎng)液負(fù)染后電鏡觀察到球形、有囊膜、直徑約為50～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子，形態(tài)結(jié)構(gòu)與BVDV顆粒相符（分離株命名為BVDV－SW）。

圖3 BVDV－SW分離株在MDBK細(xì)胞上引起的細(xì)胞病變

2.3 BVDV－SW分離毒株E2基因的擴(kuò)增、克隆與序列分析 測(cè)序結(jié)果分析顯示，BVDV－SW分離株E2基因與NADL（屬于BVDV－1）參考株的同源性為67.05%，與BVDV890、XJ－04參考株同源性分別為82.36%和84.36%，經(jīng)過(guò)Nucleotide blast分析后，與BVDV－2型同源性比較高，屬于BVDV－2型。

圖4 E2基因PCR擴(kuò)增

2.4 BVDV E2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 將分離株BVDV－SW的E2蛋白基因與GenBank發(fā)表的BVDV基因1型標(biāo)準(zhǔn)毒株和基因2型標(biāo)準(zhǔn)毒株及其他參考毒株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖6），結(jié)果顯示：進(jìn)化樹明顯分成兩個(gè)分支，分離株BVDV－SW 和17237（BVDV－2型，分離于歐洲）聚為一個(gè)小分支，與C24V、NADL（均屬于BVDV－1型）標(biāo)準(zhǔn)株的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)；BVDV－SW與XJ－04毒株關(guān)系較近，同源率較高。

圖5 E2基因重組菌液的PCR鑒定

圖6 基于BVDV E2基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論與小結(jié)

近年來(lái)，隨著新疆畜牧業(yè)的快速發(fā)展，BVDV在動(dòng)物血清中陽(yáng)性率較高。王治才等對(duì)新疆7個(gè)地區(qū)羔羊作了BVDV的感染調(diào)查，平均陽(yáng)性率為73.6%［6］。鐘發(fā)剛等通過(guò)對(duì)2006年～2008年新疆7個(gè)地區(qū)15個(gè)牛場(chǎng)472份全血樣品進(jìn)行了RTPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)42%的樣品為陽(yáng)性［7］，證實(shí)該病在新疆牛羊中廣泛流行。為了科學(xué)防控本病，目前有必要開(kāi)展該病的分子流行病學(xué)調(diào)查和病原的分離鑒定研究。

用于BVDV的分離的病料可采用疑似BVDV感染牛的血液、糞便、腸黏膜、淋巴結(jié)和脾臟等［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，采用發(fā)病牛血液從中分離出外周血單核細(xì)胞（PBMC）較易分離出BVDV。在發(fā)病牛糞便中雖然可以檢測(cè)到大量的病毒粒子，但由于糞便中存在有毒物質(zhì)，會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，易造成CPE假象，所以糞便樣品適合作為RT－PCR檢測(cè)對(duì)象而不適合作為分離病毒的材料。另外，有研究證實(shí)牛源細(xì)胞、血清及其相關(guān)制品、凍精本身存在BVDV污染，因此在分離BVDV時(shí)要先檢測(cè)分離所用的細(xì)胞和血清本身是否存在BVDV污染［9］。

現(xiàn)有的研究資料顯示，目前國(guó)內(nèi)分離鑒定的毒株以BVDV－1占優(yōu)勢(shì)地位，BVDV－2流行較少，而BVDV－2主要流行于南美、北美以及一些歐洲國(guó)家。然而隨著國(guó)際畜禽貿(mào)易活動(dòng)的增加，近幾年亞洲國(guó)家也分離到了一些 BVDV－2流行毒株［10－12］，我國(guó)也有分離到 BVDV－2毒株的報(bào)道［13－14］。鐘發(fā)剛等通過(guò)對(duì)新疆7個(gè)地區(qū)472份全血樣品中RT－PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的24份樣品擴(kuò)增出的5′－UTR測(cè)序比較發(fā)現(xiàn)，BVDV流行株基因型主要為BVDV－1b（18份）和BVDV－1c（6份），而沒(méi)有檢測(cè)到BVDV－2的感染［7］。然而，本研究證實(shí)目前在新疆某些奶牛場(chǎng)牛群中存在BVDV－2感染，并且流行毒株具有較強(qiáng)的致病力，推測(cè)這可能與近幾年日益頻繁的國(guó)內(nèi)外畜禽貿(mào)易活動(dòng)有關(guān)。本研究為新疆奶牛BVDV的科學(xué)防控提供了一定的理論依據(jù)。

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