周 勇 王 科 何忠時 吳 峰 楊 勇

有研究認為，巨噬細胞和肺泡上皮細胞分泌的促炎和促纖維化細胞因子，在放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［1］，它們之間的相互作用和影響促使了放射性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展。其中巨噬細胞的作用尤為重要［2］，文獻研究發(fā)現(xiàn)肺組織基膜的損害、修復(fù)和結(jié)構(gòu)重塑是放射性肺損傷的基本病理改變，而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)除了在細胞外基質(zhì)降解、更新和維持基膜的完整性中起主要作用外，還可以促進細胞遷移，調(diào)節(jié)多種細胞因子的活性。在放射性肺損傷動物模型中，有研究認為小鼠肺組織中 MMP-2、MMP-9表達顯著增強［3］，因此，我們認為電離輻射可能會誘導(dǎo)巨噬細胞MMP-9的合成，從而與促炎性細胞因子或促纖維化細胞因子相互作用，參與了放射性肺損傷的發(fā)生，針對該靶點的治療可能成為放射性肺損傷的有效治療手段之一。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞系RAW264.7(Mouse macrophage cell line RAW264.7)購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。含10% 熱滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以1×106個/ml密度接種到新的35 mm培養(yǎng)皿(Coring)中進行培養(yǎng)。

1.2 實驗試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(SYBR Green realtime PCR master mix-plus)購自TOYOBO公司;兔抗MMP-9多克隆抗體購自Santa Cruz公司(H-129;兔抗TIMP-1多克隆抗體購自Bioworld Technology公司(G-94);HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自美國Pierce公司。

1.3 細胞照射

傳代細胞培養(yǎng)24 h后，換為不含胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞周期同步化，置于武漢大學(xué)中南醫(yī)院放化療科60Co治療機下進行細胞照射，并立即放回細胞培養(yǎng)箱中，按實驗預(yù)定的不同時間收集細胞總RNA和總蛋白。照射參數(shù):60Co射線，SSD=80 cm，劑量率為1.389 cGy/s。

1.4 RT-PCR檢測MMP-9表達

TRIZOL Reagent法提取細胞總RNA。PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1，按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，制成cDNA，實時熒光定量反應(yīng)條件:95℃ 120 s;95℃ 15 s;58℃ 15 s;72℃ 45 s;40個循環(huán)。

表1 引物序列表

1.5 Western-blotting法檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，加入等量的2XSDS上樣緩沖液，100℃變性3 min。根據(jù)樣品蛋白濃度，取40 μg蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h，加入MMP-9多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜，漂洗后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)，室溫2 h，溫和振蕩。TBS/T振蕩清洗10 min×3次。至暗房，加ECL顯色液作用3 min，感光、洗片。根據(jù)Marker判斷顯像蛋白大小。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同劑量γ射線照射后各組細胞MMP-9 mRNA表達情況

不同劑量 γ 射線(0、5、10、20 Gy)照射細胞 6、12、24、48 h后，行實時熒光定量PCR檢測MMP-9 mRNA的表達情況見圖1。①不同劑量照射后照射6 h組與對照組比較，MMP-9基因表達均明顯增強(P＜0.05)，其中以10 Gy表達最強，為對照組的(3.46±0.45)倍;②照射12 h組較6 h組基因表達水平稍有下降，但仍高于同期對照組(P＜0.05)，組與組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，以10 Gy表達最強;③照射24 h后基因表達水平達到峰值，組與組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，其中照射劑量為10 Gy時基因表達水平是對照組的(4.75±0.14)倍;④照射48 h組基因表達水平較前有所下降，但仍高于同期對照組(P＜0.05)。上述結(jié)果可以看出照射劑量為10 Gy時，MMP-9 mRNA表達最強，其中10 Gy照射24 h后細胞MMP-9基因表達水平達到最高值。

圖1 不同劑量γ射線照射巨噬細胞系RAW264.7不同時間后MMP-9 mRNA表達情況

2.2 10Gyγ-射線照射后各組細胞 MMP-9蛋白表達情況

10 Gy γ-射線照射細胞 6、12、24、48 h 后，Western blotting檢測MMP-9蛋白表達情況見圖2，照射24 h組MMP-9蛋白表達最強，表明照射24 h后MMP-9蛋白表達水平與mRNA表達水平一致。10 Gy照射細胞6、24、48 h后MMP-9蛋白表達均有所增強，與對照組比較有差異(P＜0.05)，其中以24 h增強最顯著。

圖2 10 Gy γ-射線照射細胞不同時間后MMP-9蛋白表達情況

2.3 地塞米松對電離輻射誘導(dǎo)MMP-9蛋白表達的影響

從上述結(jié)果可以看出，10 Gy γ-射線照射細胞24 h后MMP-9蛋白表達最顯著，此時作用最強，因此，在該條件下加入地塞米松(1μM)觀察其對電離輻射誘導(dǎo)MMP-9蛋白表達的影響。由圖3可見，單純照射24 h組MMP-9蛋白表達最強，加入地塞米松后MMP-9蛋白表達較單純照射組明顯減弱(P＜0.05)，說明地塞米松可以顯著抑制電離輻射所誘導(dǎo)的MMP-9蛋白表達。

圖3 地塞米松對電離輻射誘導(dǎo)的MMP-9蛋白表達的影響

3 討論

放射治療是胸部惡性腫瘤的重要治療手段之一，但在治療過程中，當(dāng)周圍正常的肺組織接受照射劑量超過一定的閾值，則可引起急性放射性肺炎和肺纖維化。在放射性肺損傷的發(fā)展變化過程中，基膜的破壞和更新與肺組織的炎癥和纖維化有著密切的關(guān)系。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，它們的主要功能是降解細胞外基質(zhì)，并參與正常組織的重塑和修復(fù)過程。其中MMP-9主要由巨噬細胞等炎細胞產(chǎn)生，因為它的數(shù)量最多，功能最復(fù)雜，所以它是這類家族成員的代表。細胞外基質(zhì)的修復(fù)和更新必須受到嚴密而精確的調(diào)控，因為過多的或不恰當(dāng)?shù)腗MP-9的表達或活性增強均可能導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，從而引起肺組織結(jié)構(gòu)重塑導(dǎo)致相應(yīng)的肺疾病，如肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化。本實驗中 γ-射線作為1種有效的刺激使巨噬細胞MMP-9 mRNA和蛋白表達明顯增強，這與文獻報道的結(jié)果一致［4］，從而導(dǎo)致MMP-9過表達，導(dǎo)致胞外基質(zhì)過多降解，基膜通透性增加，促進炎性細胞和上皮細胞遷移，而聚集的炎細胞又可以產(chǎn)生MMP-9，如此循環(huán)而導(dǎo)致肺炎的發(fā)生和發(fā)展。在其他的肺炎和肺纖維化模型中，肺組織中的MMP-9也明顯增加，特別是在肺纖維化早期階段［5］;臨床研究發(fā)現(xiàn)細胞因子的表達(如TGF-β)與放射性肺損傷的發(fā)生密切相關(guān)［6］。而MMP-9除了具有降解胞外基質(zhì)的功能外，還可以調(diào)節(jié)細胞因子的活性，這就使細胞因子與MMP-9之間相互作用，形成網(wǎng)絡(luò)，炎癥不斷擴大，從而影響疾病的進展。在放射性肺損傷的小鼠動物模型的研究中，已發(fā)現(xiàn)電離輻射后小鼠肺組織中MMP-9表達增強，參與了肺損傷的發(fā)生［7］。這些都說明了MMP-9參與肺組織的炎癥和重構(gòu)不是偶然。

饒亞嵐等［8］研究發(fā)現(xiàn)10 Gy γ-射線作用于小鼠巨噬細胞RAW264.7 24 h后可以觀察到細胞變大，呈梭形，部分細胞伸出偽足，胞內(nèi)顆粒增多，表明細胞呈被激活狀態(tài)，而且還觀察到照射即刻細胞內(nèi)ROI(Reactive oxygen intermediate)水平開始升高，6 h到達高峰，24 h恢復(fù)正常。本實驗中 γ-射線照射巨噬細胞系RAW264.7 6 h后MMP-9 mRNA和蛋白就明顯表達，24 h達到高峰，MMP-9表達并不與照射劑量和照射時間呈正比，在10 Gy 24 h表達最明顯，說明10 Gy對細胞作用最強，與文獻報道的一致［9］。MMP-9產(chǎn)生與核因子κB的活化和ROS有關(guān)，并且與內(nèi)源性TNF-α關(guān)系非常密切。而電離輻射可以損傷DNA，產(chǎn)生ROS，激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB［9］，因此，我們推測 γ-照射引起MMP-9的產(chǎn)生可能與以下機制有關(guān):①γ-照射產(chǎn)生ROS，ROI刺激 MMP-9轉(zhuǎn)錄與合成;②激活 NF-ΚB;③誘導(dǎo)內(nèi)源性TNF-α產(chǎn)生。照射24 h后蛋白表達最顯著，這可能與內(nèi)源性的TNF-α產(chǎn)生有關(guān)，文獻認為刺激巨噬細胞后24 h才可能引起TNF-α表達且較短暫［10］。當(dāng)然也有文獻認為MMP-9產(chǎn)生與JNK和p38 MAPK等信號通路有關(guān)［11］。在臨床上，皮質(zhì)類固醇激素是用來治療放射性肺損傷的主要藥物。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)類固醇激素地塞米松可以抑制MMP-9的合成。關(guān)于γ-射線是如何調(diào)節(jié)RAW264.7 MMP-9表達這一機制仍需進一步深入的研究，MMP-9在放射性肺損傷中的詳細作用機制仍未完全闡明，以此為特異性靶點來阻斷MMP-9表達的信號通路，從而抑制MMP-9表達，中斷或干預(yù)它與細胞因子之間的相互作用，可能成為預(yù)防和治療放射性肺損傷的重要手段之一。

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