雙金權(quán) 吳 婷 莊則豪

環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2)是環(huán)氧合酶的1種異構(gòu)體，正常生理情況下在機體多數(shù)組織中不表達，可被多種刺激物如有絲分裂原、細胞因子等刺激而表達［1］。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)COX-2在胃癌組織中呈高表達，且與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關［1，2］，且 COX-2 抑制劑能抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移［3，4］。本實驗觀察了COX-2特異性抑制劑-NS398(分子式C13H18N2O5S，購于Cayman Chemical USA)對胃癌細胞CD44V6、MMP-9基因表達的影響，探討COX-2抑制劑抑制胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌細胞株SGC7901引自福建醫(yī)科大學藥理學教研室。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青公司)，NS398(分子式C13H18N2O5S Cayman，USA)，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Cayman chemical，USA)，Trizol(lifescience technology)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqDNA聚合酶(晶美公司)，DMSO(sigma)，MMP-9、CD44V6單克隆抗體(福州邁新公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

SGC7901細胞貼壁生長于含10%熱滅活小牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天0.25%胰酶消化傳代。

1.3 免疫細胞化學檢測 COX-2、CD44V6、MMP-9蛋白表達

取對數(shù)生長期SGC7901胃癌細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，苔盼蘭染色細胞成活率大于98%后，在清潔6孔板的每孔底部平放1片清潔的蓋玻片，再按每孔2×105個細胞將胃癌細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后再培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片，PBS沖洗數(shù)次，4℃冷丙酮固定10 min，PBS沖洗3次，每次3～5 min。按說明書步驟常規(guī)行S-P法染色。結(jié)果判定:細胞膜及胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

1.4 酶連免疫吸附實驗

細胞生長至培養(yǎng)瓶70%～80%時更換新鮮培養(yǎng)基，并在實驗組中加入不同量的NS398儲存液使培養(yǎng)液終濃度分別為 1、10、100、200 μmol/L，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)上清液 500 μl，12 000 r、4℃離心 5～10 min，去除細胞碎片。實驗步驟參照試劑盒說明書進行。上清液經(jīng)1∶10稀釋后加入檢測PGE2的96孔板中，各樣本在ELISA檢測儀中讀取450 nm處的吸光值，并根據(jù)試劑盒中提供的標準蛋白描繪出標準曲線并計算各樣本的PGE2含量。每個濃度設3個復孔，實驗重復3次。

1.5 MTT檢測NS398對胃癌細胞生長的影響

取對數(shù)期生長的SGC7901胃癌細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，按5×103個細胞/孔，接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)液并加入NS398，使各組培養(yǎng)液中 NS398濃度分別為 0、50、100、200 μmol/L。分別在加藥后24、48、72 h傾去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h。每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，應用酶連免疫檢測儀讀取每孔的吸光度(A0)值(λ實驗=490 nm，λ參考=630 nm)。細胞增殖抑制率(%)=［1－(實驗組)/(對照組)］×100%。實驗重復3次，每次、每濃度、每時間點均設3個復孔。

1.6 總RNA提取

SGC7901胃癌細胞胰酶消化制成單細胞懸液，按5×105個細胞/瓶，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，并加入一定量的NS398，使終濃度為 10、100、200 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，傾去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化、離心收集細胞，按105～106個細胞/1 ml Trizol加入Trizol，反復吹打至細胞完全溶解，按說明書進行總RNA提取，測 OD260/OD280≥1.80，說明RNA完整性良好，行PCR擴增。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

參照試劑說明書取總RNA 2 μg作逆轉(zhuǎn)錄反應，逆轉(zhuǎn)錄反應體系 20 μl:mRNA 2 μg，MgCL24 μl，dntp 2 μl ，amv 0.75 μl，oligo 1 μl，rnasin 0.5 μl，distilled water 補足20 μl。反應條件:42℃ 1 h，95℃ 5 min。取逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物2 μl進行PCR反應，以β-actin作為內(nèi)參照。參照文獻，各引物序列為:CD44V6［5］(129 bp)，P1:5 ＇-tccaggcaactcctagtagt-3，P2:5-cagctgtccctgttgtcgaa-3。MMP-9［6］(494 bp)，P1:5-tgggagcatggcgatggata-3，P2:5-acagtggacatggcggtctca-3。CD44V6 反應體系50 μl:10 × bufferul 5 μl，10 mM dNTP 4 μl，MgCL23 μl(25 mM)，cDNA 2 μl，Taq 酶 2U，β-actin 上下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，CD44V6 上下游引物各 2 μl(10 pmol/μl)，去離子水補足至 50 μl。在 9 700 型PCR擴增儀(Bechman)上進行PCR擴增，94℃預變性5 min后開始PCR循環(huán):95℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共擴增32個循環(huán)。最后72℃延伸10 min。MMP-9 反應體系50 μl:10 × bufferul 5 μl，10 mM dNTP 4 μl，MgCl23 μl(25 mM)，cDNA 2 μl，Taq 酶 2 U，β-actin 上下游引物各 0.5 μl(10 pmol/μl)，MMP-9上下游引物各2 μl(10 pmol/μl)，去離子水補足至50 μl。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于95℃預變性5 min后，開始PCR熱循環(huán):反應條件:95℃45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸1 min，共擴增35個循環(huán)，末次72℃延伸10 min。取8 μl產(chǎn)物加2 μl溴酚蘭混合后經(jīng)0.2%瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析儀掃描得出峰值，進行半定量分析，以CD44V6/β-actin、MMP-9/β-actin 作為其 mRNA 表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞中COX-2、CD44V6、MMP-9表達情況

免疫細胞化學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX-2、CD44V6、MMP-9在SGC7901胃癌細胞中呈陽性表達，其中 COX-2、MMP-9主要是胞質(zhì)染色，CD44V6主要是細胞膜呈陽性染色，且三者表達強度較強。

2.2 不同濃度NS398對胃癌細胞產(chǎn)生PGE2的影響

ELISA試驗發(fā)現(xiàn)，NS398可有效抑制SGC7901胃癌細胞PGE2的分泌水平。與對照組比較，當NS398濃度達10 μmol/L時，開始出現(xiàn) SGC7901胃癌細胞PGE2分泌水平下降，NS398濃度為200 μmol/L時能顯著抑制胃癌細胞PGE2的分泌，PGE2分泌水平下降了64.3%，NS398對SGC7901胃癌細胞PGE2分泌水平抑制作用呈濃度相關性，見表1和圖1。

圖1 NS398作用后胃癌細胞PGE2分泌水平的變化

表1 不同濃度NS398作用后胃癌細胞PGE2分泌水平變化

2.3 NS398對胃癌細胞生長的影響

不同濃度NS398作用不同時間，實驗組A0值均小于對照組，而DMSO(200 μmol/L)組與空白對照組比較無顯著性差異(P＜0.01)，因此，DMSO對胃癌細胞的生長無影響。當NS398濃度為50 μmol/L時，SGC7901胃癌細胞生長出現(xiàn)抑制效應，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。200 μmol/L NS398作用24 h細胞生長抑制率為30.5%，48 h為29.5%，72 h為42.9%。且發(fā)現(xiàn)NS398對胃癌細胞增殖抑制率隨其濃度的增高而增高;其中200 μmol/L NS398作用72 h對細胞增殖的抑制率最高，為42.9%，見表2、3。

表2 不同濃度NS398作用不同時間后對SGC7901胃癌細胞生長的影響

表3 不同濃度NS398作用不同時間后SGC7901胃癌細胞增殖抑制率(%)

2.4 NS398對胃癌細胞中CD44V6、MMP-9基因表達的影響

NS398作用24 h后，與對照組比較，DMSO(200 μmol/L)組CD44V6、MMP-9基因表達水平無明顯變化(P＜0.05)，DMSO 對胃癌細胞中 CD44V6、MMP-9基因表達無影響;而各實驗組mRNA相對表達量均低于對照組;200 μmol/L NS398作用24 h時，胃癌細胞中CD44V6、MMP-9基因表達水平分別下降45.7%和43.6%。NS398能在基因表達水平上抑制 CD44V6、MMP-9表達，且這種抑制效應與 DMSO無關，是由NS398 作用引起的，見表4，圖2、3、4。

圖2 SGC7901胃癌細胞中各目的基因的表達

表4 NS398對胃癌細胞中CD44V6、MMP-9基因表達的影響(/β-actin)

圖3 NS398作用后SGC7901胃癌細胞CD44V6基因表達變化

圖4 NS398作用后SGC7901胃癌細胞MMP-9基因表達變化

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，COX-2高表達與胃癌等多種腫瘤發(fā)生有關，COX-2高表達不僅促進了腫瘤的發(fā)生，且能促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2，7，8］，也有研究發(fā)現(xiàn) COX-2 抑制劑可抑制某些腫瘤細胞的黏附運動和侵襲性［4］。

NS398是1種特異性的COX-2抑制劑，可有效抑制前列腺素(PGs)的產(chǎn)生。在實驗中應用酶聯(lián)免疫吸附檢測NS398對SGC7901胃癌細胞分泌前列腺素-2(PGE2)水平的影響，發(fā)現(xiàn)NS398可有效抑制SGC7901胃癌細胞PGE2的產(chǎn)生，且抑制程度隨濃度增加而增強。200 μmol/L NS398作用24 h，胃癌細胞前列腺素分泌水平下降64.3%。NS398能有效抑制COX-2的PGE2的產(chǎn)生，從而阻斷COX-2的作用。

吳漢平等［9］將COX-2反義RNA轉(zhuǎn)染到胃癌細胞后，與對照組相比，胃癌細胞生長顯著受抑制?？梢奀OX-2參與了腫瘤生長的調(diào)控。Cheng等［10］觀察NS398對肝細胞癌生長的影響，發(fā)現(xiàn)NS398呈劑量依賴性抑制Hep3B和HKCI-4細胞的增殖，100 μmol/L使Hep3B細胞增殖下降17%，HKCI-4細胞下降15%。國內(nèi)王純雁等［11］也觀察到NS398能顯著抑制卵巢癌細胞的增殖。MTT試驗是1種有效的間接檢測細胞生長的方法，我們在實驗中應用MTT法檢測NS398對SGC7901胃癌細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度NS398作用不同時間胃癌細胞的生長均受抑制。當NS398的濃度為50 μmol/L時開始出現(xiàn)對SGC7901胃癌細胞增殖的抑制效應，且抑制效應隨其濃度增加而增強。其中200 μmol/L作用72 h對細胞增殖的抑制率為42.9%，充分顯示了NS398抑制SGC7901胃癌細胞體外生長的效應。

腫瘤細胞與基質(zhì)的黏附及基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，其中包括黏附分子CD44及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的參與。MMP-9能降解基質(zhì)便于腫瘤細胞的移動、侵襲。Yu等［12］認為CD44V6作為MMP-9在細胞表面的附著點，以確保CD44介導的腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移。Tsujii等［13］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染COX-2基因的結(jié)腸癌細胞表現(xiàn)出明顯的侵襲性，而抑制COX-2表達可見癌細胞運動、侵襲能力下降。Pan等［14］發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可顯著抑制肺癌細胞的侵襲、運動能力及 CD44V6、MMP-2的基因表達，而對MMP-9基因表達無影響。但Yao等［15］研究發(fā)現(xiàn)COX-2選擇性抑制劑NS398(100 mmol/L)能顯著降低高轉(zhuǎn)移性鼠結(jié)腸癌細胞MC-26侵襲性，且MMP-2及MMP-9的蛋白表達水平及酶活性均下降25%～30%，且癌細胞肝轉(zhuǎn)移被延緩。我們在實驗中運用RT-PCR檢測NS398作用于 SGC7901胃癌細胞24 h后 CD44V6、MMP-9基因表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)NS398作用后，胃癌細胞CD44V6、MMP-9基因表達水平有不同程度下降。200 μmol/L NS398 作用 24 h，胃癌細胞CD44V6、MMP-9基因表達分別下降45.7%和43.7%。COX-2特異性抑制劑NS398抑制了SGC7901胃癌細胞CD44V6、MMP-9基因的表達。CD44V6、MMP-9基因是腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移過程中的重要分子，因此，COX-2可能在促進胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，有可能是調(diào)節(jié)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程的一個靶點。

NS398可抑制COX-2酶的活性、阻止PGs的產(chǎn)生和釋放，因此，NS398抑制CD44V6、MMP-9表達與PGs的阻斷有關。有研究發(fā)現(xiàn)［16］，經(jīng)PGs作用后，肺癌細胞前列腺素的EP4上調(diào)，且伴隨CD44V6、MMP-2基因表達水平的升高，而抑制 PGs的釋放，可見 EP4、CD44V6、MMP-2表達水平下降;而且發(fā)現(xiàn)若使細胞內(nèi)cAMP水平升高，則 CD44、MMP-2表達上調(diào)，可見PGs、EP4、cAMP 參與 COX-2 對 CD44V6、MMP-2 基因表達的調(diào)節(jié)，而PGs并不能完全逆轉(zhuǎn)這種作用，可能NS398本身對CD44、MMP-2基因表達有抑制作用，但具體在胃癌中的作用機制需進一步探討。本實驗中發(fā)現(xiàn)NS398作用SGC7901胃癌細胞后，其CD44V6、MMP－9基因表達水平下降，但尚不明確這一作用是否為COX-2依賴性，其可能的具體信號轉(zhuǎn)導途徑需要進一步的實驗研究來明確。

本實驗發(fā)現(xiàn)，COX-2特異性抑制劑NS398可抑制CD44V6、MMP-9的基因表達，而CD44V6、MMP-9是促進胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的重要分子。COX-2及其抑制劑在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用值得進一步研究，COX-2可能是胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)過程中的一個新靶點，COX-2特異性抑制劑NS398可能成為新的抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的藥物?？梢栽O想，COX-2抑制劑將為胃癌的治療提供新的思路。

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