林燕如，陳宜菲，李粉玲

（韓山師范學院化學系，廣東潮州 521041）

金絲草為禾本科金發(fā)草屬植物金絲草（Pogonatherumcrinitum（Thunb.）Kunth）的全草，別名落蘇、墻頭竹、猴毛草、貓毛草等，分布廣，資源豐富.金絲草性寒、無毒，具有清熱、解暑、利尿之功效.金絲草中主要活性成分是黃酮[1]，但金絲草總黃酮的提取工藝及其抗氧化性的研究尚未見報道，為此本文采用正交試驗分析法對超聲波輔助提取金絲草中總黃酮的工藝條件進行優(yōu)化，并采用水楊酸法測定其清除羥自由基能力、鄰苯三酚自氧化法測定其清除超氧自由基能力和普魯士藍法測定其還原能力，為金絲草的開發(fā)利用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金絲草購自潮州南橋市場，置于60℃烘箱內干燥24 h，充分干燥后粉碎，過40目篩備用.

蘆丁對照品（國藥集團化學試劑有限公司）、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純.

KQ-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Spectrumlab 752S紫外可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）.

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制作

依據文獻[2]的方法，以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁質量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得蘆丁標液質量濃度（C）與吸光度值（A）關系曲線的線性回歸方程式為：A=9.031 8C-0.004，R2=0.998 9.

1.2.2 金絲草中黃酮含量的測定

依據文獻[2-3]的方法，取金絲草1 g，置于50 mL錐形瓶中，按一定的料液比加入乙醇溶液；采用超聲功率70 W，分別在不同乙醇濃度、料液比、超聲溫度和時間等條件下進行單因素實驗，趁熱抽濾，濾液定容至100 mL，為金絲草總黃酮提取液.以3 000 r/min，離心10 min后，取1 mL提取液置于10 mL比色管中，于波長為510 nm處測定吸光度值，再根據標準曲線方程計算黃酮含量.在單因素試驗基礎上，采用正交設計法優(yōu)化金絲草總黃酮的超聲波輔助提取工藝參數.

1.2.3 回收率試驗

采用樣品加標回收率試驗法[4-5].取4份金絲草總黃酮提取液各1 mL，其中3份加0.4 mg/mL的蘆丁標準溶液1 mL，于波長為510 nm處測定吸光值，每個樣品平行測定3次，計算回收率.回收率（%）=（V1C1-V2C2）/V0C0×100%，式中：V0：加入蘆丁標準溶液的體積（mL）；C0：蘆丁標準溶液的濃度（mg/mL）；V1：加蘆丁的樣品溶液的體積（mL）；C1：加蘆丁的樣品溶液的濃度（mg/mL）；V2：未加蘆丁的樣品溶液體積（mL）；C2：未加蘆丁的樣品溶液濃度（mg/mL）.

1.2.4 金絲草總黃酮的抗氧化試驗

（1）金絲草總黃酮對羥自由基（·OH）的清除[6-7].在5支10 mL比色管中依次加入2 mmol/L的FeSO4溶液2.5 mL和2 mmol/L的H2O2溶液2.5 mL，混合后加入6 mmol/L水楊酸溶液2.5 mL，搖勻.37℃水浴15 min，在510 nm處測其吸光度值為A0（蒸餾水為參比液）.加入0.0143 mg/mL的金絲草黃酮提取物液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，在37℃下水浴15 min，在510 nm處測其吸光度值為Ax（蒸餾水為參比液）.對羥自由基清除率的計算公式為：·OH清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100%.

（2）金絲草總黃酮對超氧自由基（O2-·）的清除[6-7].在室溫下，往6支比色管中加入66.7 mmol/L的PBS（pH 8.34）緩沖液5.0 mL；再加入0.014 3 mg/mL的金絲草黃酮提取物各0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL（不加樣品液為空白對照），最后加入2 mmol/L的鄰苯三酚1 mL，取一定量緩沖溶液使體系總體積達到9 mL，立即混勻；以蒸餾水作空白參照，在322 nm處測定吸光度值A322，每隔30 s測1次至反應啟動后的第4 min，把所得的數據以時間為橫坐標，A322值為縱坐標進行線性回歸，得到直線斜率為反應速率V自、V樣.清除率按下式計算：O2-·清除率（%）=（V自-V樣）/V自×100%（V自：不加待測液的反應速率；V樣：加入待測液的反應速率.）

（3）金絲草總黃酮的還原能力測定[8-9].在6支25 mL比色管中各加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，再依次加入濃度為0.014 3、0.028 6、0.042 9、0.057 2、0.071 5 mg/mL的總黃酮提取液2.5 mL，加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50℃恒溫20 min后，快速冷卻，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，然后以3 000 r/min離心10 min，靜置片刻后，取上層清液5 mL加蒸餾水5 mL和0.1%的三氯化鐵溶液1 mL，搖勻，靜置15 min，待溶液從黃色變?yōu)樗{色，在700 nm處測定其吸光度A.用2.5 mL的蒸餾水代替樣品液做空白.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

由圖1A可知，乙醇濃度不同，其它條件相同（超聲時間30 min，超聲功率70 W，超聲溫度30℃，料液比1∶25），總黃酮提取率開始隨乙醇濃度的增大而增加.當濃度達到50%時，總黃酮提取率最高；但當乙醇濃度再增大時，雜質的溶出量增加，提取率反而開始下降，這給后續(xù)的處理帶來了很大的不便.故將乙醇濃度定為40%～60%左右較好.

2.1.2 料液比對提取率的影響

由圖1B可以看出，料液比不同，其它條件相同（超聲時間30 min，超聲功率70 W，超聲溫度30℃，乙醇濃度50%），提取率在料液比為1∶10～1∶30時，隨著料液比增大提取率較快地增大，但當料液比大于1∶30后，提取率反而下降.因此，當料液比為1∶30時，就可以達到最佳的提取效果.在實際操作中，當浸提的料液比過小時，提取液偏少，不利于過濾分離；當浸提的料液比過大時，旋轉蒸發(fā)轉移溶劑時耗時長、耗能多.同時，料液比過大不但會增加溶劑的用量，而且會增大去除溶劑所需負荷，故料液比定在1∶25～1∶35之間較合適.

2.1.3 超聲溫度對提取率的影響

如圖1C所示，超聲溫度不同，其它條件相同（超聲時間30 min，超聲功率70 W，料液比1∶30，乙醇濃度50%），隨超聲提取時溫度的升高，提取率不斷提高；當溫度為42℃時，提取率達到4.63%；繼續(xù)升高溫度，提取率增加緩慢；同時溫度過高時，一方面其中的活性成分會被破壞，雜質的溶出量增加，給后續(xù)的處理帶來很大的不便，增加生產的成本；另一方面也會造成溶劑的損失.綜合考慮，超聲溫度應為37～47℃.

2.1.4 超聲時間對黃酮提取效果的影響

如圖1D所示，超聲時間不同，其它條件相同（超聲溫度42℃，超聲功率70 W，料液比1∶30，乙醇濃度50%），超聲時間為30 min左右效果較佳，此后提取液內的有效成分含量下降，原因可能是在長時間超聲作用下，提取率逐漸向極限值靠近，致使提取率增幅降低；同時超聲作用時間太長，會使提取粗品中雜質含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量.考慮到盡量節(jié)約時間的關系，將超聲時間定在25～35 min.

圖1 不同提取條件下金絲草總黃酮的提取率

2.2 正交試驗

選用乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比等四個主要因素進行正交試驗，以全面研究這四個因素的交叉作用對金絲草總黃酮提取率的影響.選用L9（34）正交試驗表進行試驗設計，以金絲草總黃酮提取率為試驗指標.試驗結果及極差分析見表1.

從表1與表2可知，各實驗因素及其因素水平對金絲草中總黃酮的提取率大小的影響表現(xiàn)出一定的差異性.影響金絲草總黃酮提取率的因素主次順序為A＞B＞C＞D，即乙醇濃度影響最大，其次是超聲溫度和超聲時間，料液比影響最小.綜合以上因素得到金絲草中總黃酮提取的最佳工藝條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度為50%，超聲溫度為47℃，超聲波功率為70 W，超聲時間35 min，料液比1∶35.在最佳工藝條件下進行驗證實驗，結果金絲草總黃酮提取率達3.08%，高于正交試驗5的黃酮提取率3.020%.

表 1 正交實驗結果

2.3 回收率

由表3可知，提取液中的黃酮類化合物含量的加樣回收率偏高，在106.750%-112%之間，相對標準偏差為2.580%，因此該方法準確度較高.

表 3 金絲草總黃酮的回收率

2.4 金絲草總黃酮的抗氧化作用

2.4.1 不同添加量的金絲草總黃酮對羥自由基和超氧自由基的清除效果

由圖2可知，在添加量為0.003～0.014 mg范圍內，隨著金絲草總黃酮添加量的增加，清除羥自由基和超氧自由基的效果均出現(xiàn)逐漸增強.當添加量為0.014 mg時，其對羥自由基和超氧自由基的清除率分別達到了57.380%和15.460%，表明金絲草總黃酮對羥自由基和超氧自由基有較好的清除效果.在添加量為0.011～0.014 mg范圍內時，金絲草總黃酮對羥自由基和超氧自由基的清除率隨著添加量的增加而趨于穩(wěn)定.

2.4.2 金絲草總黃酮的還原能力

由圖3可看出，金絲草總黃酮提取液具有較好的還原能力，是良好的電子供應者，其供應的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基成為較惰性的物質，以阻斷自氧化鏈鎖反應.在添加量為0.036～0.179 mg范圍內，樣品的還原能力隨著濃度的增加而增強.提示金絲草總黃酮提取液的抗氧化能力隨濃度的增加而增加.

圖2 金絲草總黃酮對羥自由基和超氧自由基的清除

圖3 金絲草總黃酮的還原能力

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗法優(yōu)化了金絲草總黃酮的超聲提取工藝，確定了金絲草總黃酮的最佳提取條件：乙醇濃度50%、料液比1∶35、超聲溫度47℃、超聲時間35 min、超聲功率70 W，在此條件下總黃酮的提取率為3.080%.

金絲草總黃酮含量較高，金絲草黃酮提取物對羥基自由基的清除效果較好，對超氧自由基有一定的清除作用，具有較好的還原能力.由此可見，金絲草具有較高的藥用價值.金絲草分布較廣，來源豐富，毒性低，價格低廉，值得在中成藥方面開發(fā)利用.

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