尚永輝,孫家卷,劉 彬,黃 怡,趙 維

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

圖1 大豆甙元的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of daidzein

蛋白質(zhì)與藥物小分子發(fā)生相互作用所生成的超分子化合物無論在光學(xué)性質(zhì)和電化學(xué)性質(zhì)方面均有異于蛋白質(zhì)與藥物單體[1]，光譜方法以及電化學(xué)方法均可應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與藥物分子之間的相互作用信息[2-3]. 相對于光譜分析方法而言電化學(xué)分析方法具有儀器設(shè)備簡單，取樣量少，選擇性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，此外電化學(xué)分析過程不受生物樣品的渾濁及其樣品顏色等的干擾；能為進(jìn)一步探討蛋白質(zhì)的亞層結(jié)構(gòu)變化和生理作用等提供重要的信息[4]. 電化學(xué)分析方法已成為目前研究生物大分子與藥物分子相互作用的常規(guī)方法之一.

大豆甙元(daidzein)屬黃酮類化合物(結(jié)構(gòu)見圖1)，具有擴(kuò)張血管，抗心律失常，降低血壓等多種藥理作用[5]，本文作者采用線性掃描伏安分析方法研究了大豆甙元與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用信息，并在此基礎(chǔ)上對相互作用的機(jī)理進(jìn)行了簡單的分析推測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)，CHI660C型)(工作電極為玻碳電極；參比電極為飽和甘汞電極；對電極為鉑電極)；pH計(jì)(上海雷磁儀器廠，pHSJ-4A型).

牛血清白蛋白(BSA，購自中國藥品生物制品檢定所)；大豆甙元(daidzein；對照品；購自中國藥品生物制品檢定所)；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水.

BSA儲備液的配制：稱取0.006 6 g BSA于50 mL小燒杯中，用二次蒸餾水溶解完全并定容到100 mL容量瓶中，得到1.0×10-3mol·L-1BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，于0～4 ℃的冰箱中保存，備用. 實(shí)驗(yàn)所需其他溶液由此儲備液稀釋得到.

大豆甙元儲備液的配制：取0.002 5 g大豆甙元標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL小燒杯中用二次蒸鎦水溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，得到1.0×10-4mol·L-1大豆甙元儲備液，于0～4 ℃的冰箱中保存，備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

玻碳電極預(yù)處理：使用前首先在0.013 mm的金相砂紙上充分打磨，此后用α-Al2O3粉末在麂皮上拋光成鏡面，再分別用水和乙醇各超聲清洗5 min后用蒸餾水淋洗干凈，用濾紙吸去多余的水分，備用[6].

依次取一定量的大豆甙元，緩沖溶液，BSA溶液分別于10 mL的比色管中，用二次蒸餾水定容至刻線；搖勻后取適量溶液于小電解池中，在0～-1.2 V電位窗口范圍內(nèi)進(jìn)行線性伏安掃描(LSV)，記錄相應(yīng)的電位(E)-電流(I)曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆甙元與牛血清白蛋白的相互作用

按照1.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大豆甙元在B-R緩沖溶液中具有一靈敏的還原峰，峰電位在-0.83 V處，加入牛血清白蛋白后，峰電流值明顯降低，而峰電位負(fù)移至-0.90 V處(如圖2所示)，表明在實(shí)驗(yàn)條件下大豆甙元與BSA之間發(fā)生了某種相互作用.

v = 100 mV/s. a: 5.0×10-5 mol·L-1大豆甙元; b: 5.0×10-5 mol·L-1大豆甙元+1.0×10-7 mol·L-1 BSA圖2 大豆甙元在B-R緩沖溶液中的線性掃描圖Fig.2 LSV of daidzein and daidzein-BSA system

2.2 大豆甙元與BSA的相互作用的條件

2.2.1 底液對峰電流的影響

實(shí)驗(yàn)中考察了Na2HPO4-NaH2PO4，Tris-HCl，B-R等緩沖體系對大豆甙元峰電流Ip的影響. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)緩沖底液對大豆甙元還原峰峰電流有較大影響，其中在B-R緩沖介質(zhì)中還原峰峰電流Ip最大，且峰型最佳，實(shí)驗(yàn)選擇B-R緩沖介質(zhì)為底液進(jìn)行研究.

2.2.2 pH對峰電流的影響

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同pH的B-R緩沖溶液對大豆甙元還原峰峰電流Ip的影響. 結(jié)果表明B-R緩沖溶液pH在4.5～6.5之間變化時(shí)，峰電流Ip隨著pH的增大而逐漸增大；pH在7.0到7.5之間，峰電流Ip變化非常緩慢. 實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.4的B-R緩沖溶液為底液進(jìn)行研究.

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對峰電流的影響

實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間對BSA與大豆甙元相互作用程度的影響. 研究發(fā)現(xiàn)：反應(yīng)時(shí)間小于18 min，大豆甙元還原峰峰電流Ip逐漸減小，表明兩者相互作用正在進(jìn)行；反應(yīng)時(shí)間大于20 min以后，峰電流Ip變化趨于穩(wěn)定，表明BSA與大豆甙元相互作用基本完全. 實(shí)驗(yàn)選擇在大豆甙元與BSA反應(yīng)時(shí)間20 min后進(jìn)行研究.

2.2.4 溫度對峰電流的影響

實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度對BSA與大豆甙元相互作用程度的影響. 研究發(fā)現(xiàn)：在B-R緩沖介質(zhì)中，溫度在292～313 K.之間變化時(shí)，混合體系峰電流Ip隨溫度的升高而增大，表明隨著溫度升高，BSA與大豆甙元相互作用生成的物質(zhì)部分離解，導(dǎo)致相互作用程度減弱，體系中游離的大豆甙元量增加，導(dǎo)致峰電流Ip升高. 實(shí)驗(yàn)選擇在290 K下進(jìn)行研究.

2.2.5 掃描速率對峰電流的影響

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了掃描速率v對峰電流Ip的影響，研究發(fā)現(xiàn)：掃描速率v在0.10～0.80 V/s范圍逐漸變化，峰電流Ip隨掃描速率v的增大而逐漸增加，表明該電極反應(yīng)過程具有一定的吸附性.

2.3 大豆甙元與BSA的相互作用機(jī)理的探討

2.3.1 大豆甙元與BSA作用過程中轉(zhuǎn)移系數(shù)及表觀電子傳遞速率常數(shù)的測定

轉(zhuǎn)移系數(shù)α是電化學(xué)研究中十分重要的一個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù). 依據(jù)Laviron理論[7]，當(dāng)所研究的對象是僅僅受到吸附過程控制的準(zhǔn)可逆體系時(shí)，陰極峰峰電位Ep應(yīng)遵循如下關(guān)系式：

EP=E0+(RT/αnF)ln(RTks/αnF)-(RT/αnF)lnv

該式表明還原峰峰電位Ep與掃描速率v的常用對數(shù)lnv呈線性函數(shù)關(guān)系，繪制Ep-lnv函數(shù)曲線，直線斜率為-RT/(αnF)，由此可求得轉(zhuǎn)移系數(shù)α；進(jìn)而根據(jù)曲線截距可求得表觀電子傳遞速率常數(shù)ks[8].

在實(shí)驗(yàn)條件下，體系峰電位Ep與掃描速率v(v=0.05～0.6 V/s)的自然對數(shù)關(guān)系曲線方程為：Ep= -0.034 9 lnv-1.033 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，依據(jù)峰電位Ep與掃描速率v的自然對數(shù)lnv的關(guān)系式，得知曲線斜率RT/(αnF)為-0.034 9，由此得到：αn= 0.735 8，考慮到大豆甙元為二羥基異黃酮，酚羥基的電化學(xué)反應(yīng)過程已被廣泛證明為雙質(zhì)子，雙電子轉(zhuǎn)移過程，取n=2,計(jì)算得出轉(zhuǎn)移系數(shù)α= 0.367 9.

表觀電子傳遞速率常數(shù)ks可由下式求算：

lgks=clg(1-α) +(1-α)lgα-lg[RT/(nFv)]-α(1-α)nFΔVp/(2.303RT)

根據(jù)公式計(jì)算，得出該電極反應(yīng)的表觀電子傳遞速率常數(shù)ks為1.39 s-1.

2.3.2 大豆甙元與BSA相互作用過程結(jié)合常數(shù)β和結(jié)合數(shù)m的求算

通過研究表明實(shí)驗(yàn)條件下大豆甙元(簡寫為F)與BSA相互結(jié)合形成了一種非電活性超分子化合物BSA-F，結(jié)合過程可用如下的關(guān)系描述：

根據(jù)上式，反應(yīng)過程的結(jié)合常數(shù)可表示為：β=cBSA-mF/[(cF)mcBSA]

對該式進(jìn)行進(jìn)一步推導(dǎo)得到：

lg[ΔIp/(ΔIpmax-ΔIp)]=lgβ+mlgcF

公式中ΔIpmax為加入BSA前后大豆甙元溶液體系還原峰峰電流Ipa差值的最大值.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大豆甙元與BSA結(jié)合過程lg[ΔIp/(ΔIpmax-ΔIp)]與lgcF成線性關(guān)系，表明大豆甙元分子和BSA相互作用只形成了一種單一的締合物，曲線的斜率為大豆甙元與BSA相互作用的結(jié)合數(shù)m，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到m= 0.942 1 ≈ 1；曲線截距為大豆甙元與BSA結(jié)合常數(shù)的對數(shù)lgβ，通過計(jì)算求得β= 8.29×105L·mol-1.

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