楊筱慧，朱道弘，劉志偉

(1. 中南林業(yè)科技大學昆蟲行為與進化生態(tài)學實驗室，中國 長沙 410004；2. Department of Biological Sciences, Eastern Illinois University, Charleston, Illinois 61920, USA)

沃爾巴克氏體Wolbachia是一類與宿主胞質(zhì)共生的微生物，在分類上屬Proteobacteria的α亞門；其主要的宿主有節(jié)肢動物及線蟲等．估計昆蟲種類總數(shù)中17%～66%[1-4]感染了Wolbachia；一些昆蟲種類甚至感染W(wǎng)olbachia多個株系，如甲蟲[5]、癭蜂[6]、螞蟻[7]、蝴蝶[8]、赤眼蜂[9]、果蠅[10]．Wolbachia能以誘導(dǎo)雄性致死(male-killing)、孤雌生殖(parthenogenesis-inducing)、宿主胞質(zhì)不親和(cytoplasmic incompatibility)和雌性化(feminizing)[3]等方法控制被感染昆蟲的生殖方式．基于其對宿主的特殊作用，一些學者認為Wolbach與宿主的共生、性別決定、物種形成等重要生物學問題密切相關(guān)[4]．

癭蜂亞科分6族(tribe)，即草癭蜂族Aylacini、豆癭蜂族Eschatocerin、薔薇癭蜂Diplolepidini、槭癭蜂族Pediaspidili、櫟癭蜂族Cynipini和客癭蜂族Synergini[11]．除客癭蜂族外，其他族的癭蜂誘導(dǎo)寄主植物形成形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蟲癭，為造癭癭蜂；客癭蜂族本身不造癭，而是寄居于其他造癭癭蜂的蟲癭內(nèi)并共享造癭癭蜂的蟲癭組織[11]．已有的研究表明：癭蜂有3種繁殖方式，即產(chǎn)雌孤雌生殖(thelyotoky)、周期性孤雌生殖(cyclical parthenogenesis)、產(chǎn)雄孤雌生殖(arrhenotoky)[12]．在癭蜂亞科中，草癭蜂族有4種、櫟癭蜂族有9種、薔薇癭蜂族有11種、客癭蜂族有6種感染了Wolbachia[6, 13-15]；其中，草癭蜂族和薔薇癭蜂族一些種類的產(chǎn)雌孤雌生殖與Wolbachia有關(guān)[14]；而櫟癭蜂族一些種類的產(chǎn)雌孤雌生殖與Wolbachia無關(guān)[13-15]．

為研究Wolbachia對客癭蜂族癭蜂感染的方式及Wolbachia對客癭蜂族癭蜂生殖方式的影響，作者從湖南長沙采集向川安癭蜂Andricusmukaigawae和麥氏安癭蜂Andricusmairei蟲癭，在這兩種蟲癭中，都獲得了客癭蜂族的日本并腹客癭蜂Synergusjaponicus．作者以日本并腹客癭蜂Synergusjaponicus為材料，使用Wolbachia的wsp基因特異引物，利用PCR法擴增日本并腹客癭蜂中Wolbachia的wsp基因的特異片段，以證實日本并腹客癭蜂Wolbachia的多重感染，在此基礎(chǔ)上討論多重感染的Wolbachia對日本并腹客癭蜂生殖方式的影響．

1 材料、方法

1.1 樣本采集和計算公式

2010年9月至2011年5月從湖南長沙暮云鎮(zhèn)(N27°51′，′E112°55′)和路口鎮(zhèn)范林鄉(xiāng)(N28°23′，E113°17′)采集向川安癭蜂和麥氏安癭蜂蟲癭，分別置于室溫條件下的養(yǎng)蟲籠內(nèi)讓其成蟲羽化．在2種癭蜂蟲癭中均獲得了日本并腹客癭蜂的羽化成蟲，獲得的樣本以無水乙醇浸泡，于-40 ℃冰柜保存．向川安癭蜂和麥氏安癭蜂的寄主植物分別為白櫟QuercusfabriHance和短柄枹櫟Quercusglanduliferavar.brevipetiolataNakai．

性比計算公式：性比=雌性樣本量/ 樣本總量×100%.

1.2 樣本總DNA提取和DNA模板質(zhì)量的檢測

從向川安癭蜂和麥氏安癭蜂蟲癭中所獲日本并腹客癭蜂中各取10個雌成蟲，樣本總DNA提取參照Zhu等[14]的方法．DNA模板質(zhì)量根據(jù)Folmer方法，使用節(jié)肢動物COI特異引物LCO1490和HCO2198，對每個樣本進行PCR擴增[16]來進行檢測；獲得的COI-PCR產(chǎn)物大小約為660 bp，檢測結(jié)果為陽性的模板DNA用于Wolbachia檢測．

1.3 日本并腹客癭蜂Wolbachia的wsp基因檢測和測序

日本并腹客癭蜂Wolbachia的wsp基因片段的PCR擴增使用特異引物為wspF和wspR[17]，wsp-PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考Zhu等[14]的方法．PCR反應(yīng)的陽性對照和陰性對照分別為已知感染的栗癭蜂Dryocosmuskuriphilus的Wolbachia株系和純凈水．分別隨機選3個Wolbachia的wsp-PCR產(chǎn)物，交由上海英俊生物有限公司直接雙向測序．

1.4 日本并腹客癭蜂Wolbachia的wsp基因的序列分析和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

以DNAsp version 4.10.2軟件分析Wolbachia的wsp基因G+C含量、遺傳多樣性(Pi)和變異位點數(shù)目(VI)．從GenBank下載其他癭蜂和昆蟲感染的Wolbachia株系的wsp序列，使用Clustal X 2.0軟件將本研究獲得的阿氏客癭蜂Wolbachia的wsp序列與下載的相應(yīng)序列排列對齊；排列對齊的wsp序列長度分別為595 bp．通過Model-Test 3.7[18]軟件篩選wsp基因的進化模型，其最優(yōu)進化模型為GTR + G．通過MEGA 5.0[19]軟件，根據(jù)GTR + G模型設(shè)定Gamma參數(shù)，計算Kimura 2-parameter遺傳距離，使用鄰位相連法 (neighbor-joining method) 構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹；自導(dǎo)復(fù)制值為1 000次．外群為顯棒赤眼蜂Trichogrammasemblidis的Wolbachia株系的wsp序列．

2 結(jié)果

2.1 日本并腹客癭蜂的性比和Wolbaciha感染率

從向川安癭蜂蟲癭中獲日本并腹客癭蜂共92只，其雌性率為80.4%；其Wolbachia的感染率為60%．從麥氏安癭蜂蟲癭中獲日本并腹客癭蜂共48只，其雌性率為77.1%；其Wolbachia的感染率為35% (表1)．

表1 蟲癭的采集信息、日本并腹客癭蜂的雌雄性比和Wolbachia的感染率

§為PCR檢測昆蟲數(shù)．

2.2 日本并腹客癭蜂Wolbachia的wsp序列的分子特征和系統(tǒng)發(fā)生樹

從向川安癭蜂獲得的日本并腹客癭蜂感染了Wolbachia的Wmuk株系，而從麥氏安癭蜂蟲癭獲得的日本并腹客癭蜂感染了Wolbachia的Wmai株系．Wmuk和Wmai株系的wsp-PCR產(chǎn)物的堿基長度分別為536 bp和539 bp，已向Genbank提交序列，其序列登錄號分別為KC130969和KF040477；經(jīng)Genbank的Blast工具比較,二者的堿基序列的一致性僅為77%，序列差異大．Wsp基因堿基平均G+C含量為37.2%，核苷酸的多樣性為0.236，變異位點數(shù)為125，占總堿基數(shù)的22.9%．

以日本并腹客癭蜂的Wolbachia的Wmuk、Wmai和其他癭蜂的Wolbachia的wsp序列構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)．圖中分支間的數(shù)字指基于1 000次自導(dǎo)復(fù)制的bootstrap值；黑體字指癭蜂種類．從分子系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出：日本并腹客癭蜂的Wolbachia的Wmuk和Wmai株系同屬A群；W1株系和麥氏安癭蜂及地中海粉螟感染的Wolbachia株系聚為一分支，W2株系獨立為一分支．

圖1 日本并腹客癭蜂和其他癭蜂Wolbachia的wsp序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of wsp gene sequences of Wolbachia in S. japonicus and other gall wasps

3 討論

癭蜂亞科已知約1 400余種，于菊科、殼斗科等寄主植物上形成蟲癭，影響植物正常生長，如栗癭蜂嚴重危害板栗等植物，是重要森林害蟲[12]．Wolbachia能調(diào)控宿主昆蟲的生殖模式，可用于害蟲的生物防治．本研究中，作者使用Wolbachia的wsp基因的特異引物，通過PCR確認，不同蟲癭的日本并腹客癭蜂種群均有Wolbachia感染，感染率為35%～60%．從向川安癭蜂和麥氏安癭蜂蟲癭獲得的日本并腹客癭蜂均有雌、雄，且未見性別的明顯偏離，因此其生殖方式應(yīng)為有性生殖.所以，作者推測Wolbachia并未誘導(dǎo)阿氏客癭蜂進行孤雌生殖，但應(yīng)在后續(xù)研究中對阿氏客癭蜂進行抗生素處理來消除Wolbachia，并觀察阿氏客癭蜂性比變化才能確認該結(jié)論．

不同蟲癭的日本并腹客癭蜂種群Wolbachia的wsp序列一致性僅77%，差異較大，顯然屬于不同的Walbachia株系．Wolbachia的傳播方式主要為種內(nèi)的垂直傳播，即母代感染的細菌經(jīng)卵細胞的細胞質(zhì)傳播至子代，但也存在種間或種內(nèi)的水平傳播現(xiàn)象[1]．如Rokas等發(fā)現(xiàn)3種客癭蜂S.reinhardi，S.diaphanus，S.umbraculus與櫟癭蜂族的1種造癭蜂A.solitarius(strain 3)；1種客癭蜂S.crassicornis與櫟癭蜂族的2種造癭蜂A.solitarius(strain 1)、Neuroterusmacropterus，Wolbachia的wsp基因序列完全一致，認為是Wolbachia在客癭蜂和造癭癭蜂間水平轉(zhuǎn)播的結(jié)果[6]．日本并腹客癭蜂的向川安癭蜂、麥氏安癭蜂種群的不同株系顯然不是種內(nèi)垂直傳播的結(jié)果，其中之一或二者可能來源于種間的水平傳播．

同一宿主感染不同株系Wolbachia，即為Wolbachia的多重感染；果蠅Drosophilasimulans[4]的研究表明，在這種情況下，宿主交配時會出現(xiàn)胞質(zhì)不相容，并產(chǎn)生生殖隔離．Wolbachia的多重感染是否也會誘導(dǎo)阿氏客癭蜂的不同個體或種群間的胞質(zhì)不相容，并產(chǎn)生生殖隔離?這有待進一步研究．

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