周 勇， 王 征， 林元山

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國 長沙 410128；2.長沙水地沙生物科技有限公司，中國 長沙 410125)

當(dāng)今全世界化學(xué)農(nóng)藥年產(chǎn)量超過2 Mt,有500多種在農(nóng)業(yè)中使用，造成環(huán)境嚴(yán)重污染，生態(tài)遭到破壞，害蟲抗藥性增強(qiáng)，人畜常中毒傷亡[1]．而生物防治制劑對人畜、植物無傷害，安全可靠，不污染環(huán)境，能有效地保持生態(tài)平衡． 枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)是一種好氧產(chǎn)芽胞的革蘭陽性細(xì)菌，其生理特征豐富多樣，分布廣泛，極易分離培養(yǎng)．該菌能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力．對許多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物，小麥白粉病、黃瓜枯萎病[2]、胡蘿卜立枯病[3]、煙草黑脛病[4]等多種植物病害有明顯的防治效果；已在農(nóng)業(yè)生物防治、畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥及分子生物學(xué)研究等方面廣泛應(yīng)用[5]，顯示了一定的社會效益和生態(tài)效益．枯草芽胞桿菌最突出的特征是生長快、營養(yǎng)簡單、能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽胞，這也有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖[6].本研究通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，提高發(fā)酵液中芽胞含量，降低生產(chǎn)成本，為枯草芽胞桿菌微生態(tài)制劑生產(chǎn)提供技術(shù)參考．

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌 枯草芽胞桿菌ACCC-10619，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心．

1.1.2 培養(yǎng)基 固體平板培養(yǎng)基：麩皮(過178 μm篩)3.0 g，瓊脂2.0 g，自來水100 mL，121 ℃滅菌25 min．

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)：麩皮(過178 μm篩)3.0 g，自來水100 mL，121 ℃滅菌25 min．

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 搖瓶發(fā)酵試驗 在250 mL的三角瓶中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的麩皮為基本培養(yǎng)基，添加不同種類和濃度的碳源、氮源、無機(jī)鹽后，加入自來水定容至100 mL；并在不同單因素條件(溫度、pH、發(fā)酵時間、靜止時間)下，每個水平3次重復(fù)，滅菌接種后置于180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后取樣測芽胞數(shù)量，根據(jù)芽胞數(shù)量高低確定最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件[7]．

1.2.2 100 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗 在搖瓶發(fā)酵正交試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行100 L液體發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)．

1.3 生物量的測定

芽胞計數(shù)方法，參照GB20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》．

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel、DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素?fù)u瓶發(fā)酵優(yōu)化試驗

2.1.1 麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對枯草芽胞桿菌產(chǎn)芽胞的影響 依次選擇液體發(fā)酵培養(yǎng)基的麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(過178 μm篩)3.0%～8.0%，在180 r/min 、35 ℃搖床發(fā)酵48 h，測定發(fā)酵液中的芽胞數(shù)量(圖1)．當(dāng)麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.0%時枯草芽胞桿菌產(chǎn)芽胞數(shù)最多，達(dá)2.61×1013個/L，但麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%～6.0%時無顯著差異(P<0.05)，考慮到麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，泡沫越多，容易粘壁的問題，選擇麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%為發(fā)酵基本培養(yǎng)基．

2.1.2 不同碳源對枯草芽胞桿菌產(chǎn)芽胞的影響 結(jié)果見圖2．添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的葡萄糖芽胞數(shù)達(dá)6.55×1013個/L，與其他碳源差異顯著，說明葡萄糖作為快速利用碳源有利于枯草芽胞桿菌迅速繁殖[8]，也有利于菌體快速進(jìn)入休眠期．

圖1 培養(yǎng)基麩皮濃度對枯草芽胞桿菌ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.1 Effects of Bran medium concentration on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

圖2 不同碳源對枯草芽胞桿菌ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.2 Effects of carbon source concentration on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

2.1.3 不同氮源對枯草芽胞桿菌產(chǎn)芽胞的影響 結(jié)果見圖3．菌株芽胞數(shù)以有機(jī)氮源蛋白胨最占優(yōu)勢，無機(jī)氮源硫酸銨次之，分別達(dá)4.12×1013個/L，3.89×1013個/L．說明該菌既能利用有機(jī)氮源又能利用無機(jī)氮源，但硫酸銨廉價易得[9]，應(yīng)作首選．

2.1.4 無機(jī)鹽對菌株產(chǎn)芽胞的影響 結(jié)果見圖4．硫酸錳對芽胞產(chǎn)量影響最大，差異明顯，其次是氯化鈉，分別達(dá)5.84×1013個/L，4.38×1013個/L．其他無機(jī)鹽對芽胞產(chǎn)量無顯著影響，錳是枯草芽胞桿菌生長的必需元素，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少 Mn2+時，不適合枯草芽胞桿菌的生長，Mn2+也是酶的輔助因子，對菌體生長和芽胞形成有顯著的效果，因此確定硫酸錳為最佳無機(jī)鹽．

圖3 不同氮源對枯草芽胞桿菌ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.3 Effects of nitrogen source types on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

圖4 無機(jī)鹽對菌株ACCC-10619發(fā)酵產(chǎn)芽胞的影響Fig.4 Effects of inorganic salt types on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

2.1.5 溫度對菌株產(chǎn)芽胞的影響 結(jié)果見圖5．菌體在31～37 ℃之間生長較好，在33 ℃時芽胞形成率最高，35 ℃次之，分別達(dá)3.85×1013個/L，3.35×1013個/L．溫度主要是改變酶的合成和活力等從而影響菌體的生長[10]，溫度過低酶的反應(yīng)速率降低，過高則會導(dǎo)致酶失活，因此33 ℃是芽胞形成最適溫度．

2.1.6 培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)芽胞的影響 培養(yǎng)基初始pH影響菌株產(chǎn)芽胞的結(jié)果見圖6．從圖6可見，初始pH 值為7.0時芽胞產(chǎn)量最高，pH 7.5時次之，分別達(dá)3.34×1013個/L，2.98×1013個/L．酸性和強(qiáng)堿性條件均不利于菌體生長和芽胞形成，所以培養(yǎng)基初始pH在7.0左右為宜．

圖5 溫度對菌株ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.5 Effects of temperature on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

圖6 培養(yǎng)基初始pH 值對菌株ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.6 Effects of initial pH value on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

2.1.7 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)芽胞的影響 結(jié)果見圖7．在搖瓶培養(yǎng)36 h后芽胞產(chǎn)量最高，48 h略微減少，分別達(dá)3.36×1013個/L，3.03×1013個/L，若繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，菌體進(jìn)入自溶階段．考慮到發(fā)酵周期短能降低生產(chǎn)成本提高生產(chǎn)效率、降低染雜菌的機(jī)率[11]，所以確定最佳發(fā)酵時間為36 h．

2.1.8 靜置時間對菌株產(chǎn)芽胞的影響 結(jié)果見圖 8．靜置12 h后芽胞產(chǎn)量最高，隨著靜置時間增加，芽胞數(shù)量也隨之減少，發(fā)酵后靜置其溶氧不足會促使芽胞的形成，但靜置時間太久芽胞會形成菌體，并且菌體衰老加快，營養(yǎng)不足引起菌體自溶等[12]，降低了發(fā)酵液中的生物量，所以最佳靜置時間為12 h．

圖7 培養(yǎng)時間對菌株ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.7 Effects of fermentation period on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

圖8 靜置時間對菌株ACCC-10619產(chǎn)芽胞的影響Fig.8 Effects of standing time on fermentation spore amount of strain ACCC-10619

2.2 多因素正交試驗結(jié)果

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基為麩皮3.0%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，硫酸錳0.05%，硫酸銨0.5%，自然pH條件下，采用L9(34)正交設(shè)計方案[13]，選擇培養(yǎng)時間、溫度、葡萄糖濃度3個主要影響因素，進(jìn)行3因素3水平實驗．正交試驗因素水平及結(jié)果見表1，方差顯著性分析見表2．實驗結(jié)果表明：不同因素組合，發(fā)酵液中的芽胞數(shù)量不同，經(jīng)9種正交試驗組合的篩選，3種因素對其生長量的影響從大到小順序是發(fā)酵時間、溫度、葡萄糖濃度，說明發(fā)酵時間對芽胞形成的影響最大，優(yōu)組合為A2B2C2，即發(fā)酵周期36 h、溫度33 ℃、葡萄糖濃度3.0%．由于最優(yōu)組合A2B3C2不在試驗設(shè)計內(nèi)，尚需驗證．給定a=5%，查表Fa(2,2)=19，易見FA<19，F(xiàn)B<19，F(xiàn)C>19．發(fā)酵時間影響具有顯著性．經(jīng)驗證，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基為麩皮3.0%，硫酸錳0.05%，葡萄糖3.0%，自然pH，發(fā)酵溫度33 ℃，發(fā)酵周期36 h，靜置12 h條件下，枯草芽胞桿菌數(shù)量達(dá)7.83×1013個/L．

表1 L9(34) 正交優(yōu)化試驗因素水平及結(jié)果

2.3 100 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)

圖9 100 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)芽胞過程曲線Fig.9 The growth curve of strain ACCC-10619 in 100 L fermentation tank

在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，以100 L液體發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，從發(fā)酵12 h開始，每隔6 h(分別在12、18、24、30、36、42、48、54、60 h)取發(fā)酵液，測定枯草芽胞桿菌芽胞數(shù)．從圖9可以看出，0～18 h菌體產(chǎn)芽胞很少，24～36 h芽胞數(shù)量逐漸增大，達(dá)到最大值；36～48 h芽胞數(shù)沒有明顯變化，數(shù)量穩(wěn)定在8.5×1013個/L左右，48 h后菌體數(shù)量開始逐漸減少，菌體衰老加速，菌體開始自溶，菌體進(jìn)入了衰亡期．發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)[14]發(fā)酵周期與搖瓶發(fā)酵周期基本一致．

3 結(jié)論與討論

本研究通過單因素實驗和多因素正交優(yōu)化實驗，確定了枯草芽胞桿菌ACCC-10619產(chǎn)芽胞最佳培養(yǎng)基配方為：麩皮3.0%、葡萄糖3.0%、硫酸錳0.05%、硫酸銨0.5%、溫度33 ℃、發(fā)酵周期36 h、靜置時間12 h．芽胞產(chǎn)量為8.5×1013個/L，正交實驗結(jié)果表明：發(fā)酵時間對芽胞形成影響最大，其次是溫度和葡萄糖濃度，在發(fā)酵到一定階段，菌體出現(xiàn)衰退，受營養(yǎng)物質(zhì)減少及菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等因素影響，芽胞產(chǎn)率開始下降，所以在工業(yè)生產(chǎn)中要及時放罐．溫度對芽胞形成也至關(guān)重要，溫度過高會殺死菌體，溫度過低芽胞桿菌生長代謝緩慢，營養(yǎng)體難以形成，芽胞更難以在營養(yǎng)體內(nèi)產(chǎn)生．葡萄糖為速效碳源，其濃度過高會使菌體代謝過快，呼吸加速增加耗氧，同時它會產(chǎn)生一些酸性中間代謝產(chǎn)物和抑菌物質(zhì)，降低pH值且使菌體后續(xù)生長缺乏營養(yǎng)，不利于菌體生長和芽胞形成．枯草芽胞桿菌ACCC-10619為國內(nèi)產(chǎn)芽胞優(yōu)勢菌株，比王振海報道的豬源益生芽胞桿菌菌株產(chǎn)量2.33×1013個/L[15]高了3.6倍，此發(fā)酵培養(yǎng)基配方簡單，廉價易得，發(fā)酵周期短，芽胞產(chǎn)量高，可以用于規(guī)?；a(chǎn)．本研究還對枯草芽胞桿菌發(fā)酵液成型的后期處理進(jìn)行了一定研究，并得到了相應(yīng)過濾、干燥及菌劑稀釋等條件方法，但還存在菌體的收集、分裝、保存等一系列問題，有待進(jìn)一步研究來完善產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)及延長產(chǎn)品的貨架期．

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