付彩霞，高宗華，王海英

(濱州醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，山東 煙臺(tái) 264003)

圖1 葉酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecule structure of folic acid

葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特征相近的化合物的統(tǒng)稱，屬于B族維生素. 葉酸在機(jī)體內(nèi)的許多酶反應(yīng)中起著輔酶的作用，故也稱為葉酸輔酶. 葉酸由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸和左旋谷氨酸三部分組成，含α和β兩個(gè)羧基，結(jié)構(gòu)式如圖1所示. 有研究表明，人體缺乏葉酸會(huì)引起心臟病及胎兒神經(jīng)軟管缺陷等疾病[1]. 葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，對(duì)預(yù)防心血管疾病的發(fā)生具有重要的生物學(xué)意義[2].

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，它具有廣泛的結(jié)合能力, 能結(jié)合內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[3]，并能結(jié)合生物體內(nèi)存在的多種微量元素，因此，研究藥物與血清白蛋白和金屬離子的相互作用，對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的存在狀態(tài)、運(yùn)輸、吸收與代謝及藥理作用具有重要意義[4]. 有關(guān)葉酸與人血清白蛋白的相互作用已有報(bào)道[5-6]，但尚未見(jiàn)有金屬離子Fe3+參與葉酸與生物大分子的相互作用研究的報(bào)道.

作者用熒光光譜法和紫外光譜法在生理?xiàng)l件下研究了葉酸與牛血清白蛋白及金屬離子Fe3+的相互作用，獲得了一些有價(jià)值的信息，為今后藥物合成和臨床用藥提供了有益參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LS-55型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer公司)；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；pH-3C酸度計(jì)(上海逸龍科技有限公司)；電子分析天平(AR1140,ohaus,corp.pineBrook,Nj,USA)；電熱恒溫水浴鍋(龍口市先科儀器公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

牛血清白蛋白(生化試劑，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；葉酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

用0.1 mol·L-1pH = 7.40 Tris-HCl(內(nèi)含0.10 mol·L-1的NaCl溶液以維持離子強(qiáng)度)緩沖溶液配制濃度為1.10 × 10-5mol·L-1的牛血清白蛋白溶液；葉酸用0.5%氨水溶液溶解，用二次蒸餾水定容后濃度為1.13 × 10-3mol·L-1；配制濃度為1.00 × 10-3mol·L-1的Fe(NO3)3溶液；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，經(jīng)檢測(cè)均無(wú)熒光雜質(zhì)，其他試劑均為分析純. 以上溶劑均放入冰箱避光保存至4 ℃.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜測(cè)定方法

取3 mL BSA溶液于石英比色皿中，依次加入10 μL FA溶液(加入體積<100 μL，忽略體積對(duì)濃度的影響)，搖勻，靜置5 min，25 ℃、37 ℃下掃描熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，記錄350 nm處的熒光強(qiáng)度.

固定BSA(1.10 × 10-5mol·L-1)和金屬離子Fe3+(1.00 × 10-5mol·L-1)的濃度，改變FA的濃度，25 ℃、37 ℃下掃描熒光光譜.

1.2.2 紫外光譜測(cè)定方法

以pH = 7.40的Tris-HCl緩沖溶液作參比，記錄室溫下在200～400 nm的FA與Fe3+的紫外光譜.

1. BSA， 2. BSA-Fe3+, 3. BSA-FA, 4. BSA-FA-Fe3+c(BSA) = 1.10×10-5mol·L-1,c(Fe3+) = 1.00×10-5mol·L-1,c(FA) = 1.13×10-5mol·L-1圖2 FA和Fe3+對(duì)BSA熒光發(fā)射光譜的影響Fig.2 The effects of FA and Fe3+ on the fluorescent spectrum of BSA

2 結(jié)果與討論

2.1 FA與BSA作用的熒光光譜

蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光. BSA以280 nm激發(fā)時(shí)，在350 nm處有最大熒光特征發(fā)射峰. BSA、BSA-Fe3+、BSA-FA、BSA-FA-Fe3+體系的熒光光譜如圖2所示. 由圖2可知，F(xiàn)A的加入使BSA在350 nm處的熒光特征發(fā)射峰強(qiáng)度明顯降低(圖2中曲線1和3)，F(xiàn)e3+離子的存在同樣使BSA的熒光特征發(fā)射峰強(qiáng)度降低(圖2中曲線1和2). 當(dāng)FA和Fe3+同時(shí)存在時(shí)，BSA的熒光特征發(fā)射峰強(qiáng)度降到最低(圖2中曲線1和4). 這表明FA和Fe3+對(duì)BSA熒光具有協(xié)同猝滅作用.

2.2 FA與BSA的相互作用

熒光猝滅作用因猝滅機(jī)制不同可分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅[7]兩種. 動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅作用可用Stern-Volmer方程來(lái)描述，即

F0/F=1+KSVc(FA) =1+Kqτ0c(FA)

(1)

式中F0和F為猝滅劑不存在和存在時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度(單位a.u.)，c(FA)為猝滅劑葉酸的總濃度(單位mol·L-1)，KSV為猝滅常數(shù)(單位L·mol-1)，τ0為生物大分子的熒光壽命(單位s)，約為10-8s[8]，Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)(單位L·moL-1·s-1). 在25 ℃、37 ℃溫度下，試驗(yàn)了有/無(wú)Fe3+離子存在時(shí)不同濃度FA對(duì)BSA熒光強(qiáng)度的影響，以F0/F對(duì)c(FA)作Stern-Volmer曲線圖(圖3)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)線性擬合得到KSV，根據(jù)KSV=Kqτ0，可求得25 ℃、37 ℃的Kq(列于表1). 由表1可知，無(wú)論有無(wú)Fe3+離子存在，F(xiàn)A與BSA結(jié)合反應(yīng)的Kq都遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，表明FA對(duì)BSA內(nèi)源熒光的猝滅過(guò)程不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程[9]. 并且靜態(tài)猝滅常數(shù)Kq隨溫度升高而減小，更進(jìn)一步證明該過(guò)程是靜態(tài)猝滅.

圖3 有/無(wú)Fe3+離子存在下FA與BSA的Stern-Volmer曲線Fig.3 Stern-Volmer curves of BSA and FA with/without Fe3+

t/℃Kq(L·mol-1·s-1)K(L·mol-1)nΔH(kJ·mol-1)ΔS(J·mol-1·K-1)ΔG(kJ·mol-1)無(wú)Fe3+252.42×10135.35×1061.29-28.8330.05-38.38371.74×10133.41×1061.27-28.8332.06-38.77Fe3+252.41×10134.96×1061.28-74.86-123.02-38.20371.73×10131.54×1061.20-74.86-123.03-36.72

2.3 FA與BSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

根據(jù)靜態(tài)猝滅理論和關(guān)系式

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlgc(FA)[10]

(2)

(式中K為藥物與白蛋白分子的表觀結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)),以lg[(F0-F)/F]對(duì)lgc(FA)作圖(圖4). 由圖中的斜率，得表觀結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(表1). 從表1可知，有/無(wú)Fe3+離子存在時(shí)，F(xiàn)A與BSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)基本不變，表觀結(jié)合常數(shù)K在106數(shù)量級(jí)，說(shuō)明葉酸和牛血清白蛋白之間具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，且K隨溫度升高而減小，這是因?yàn)镕A-BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低.

圖4 有/無(wú)Fe3+離子存在下lg[(F0-F)/F]對(duì)lgc(FA)的關(guān)系曲線圖Fig.4 The relation of lg[(F0-F)/F] and lgc(FA)with/without Fe3+

2.4 FA與BSA作用力類型[11]的確定

藥物和蛋白質(zhì)之間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電作用力、疏水作用力. 根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小，可以判斷藥物和蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型. 當(dāng)ΔS>0時(shí)，通常為疏水作用力的表現(xiàn)；而ΔH<0，ΔS>0，是靜電作用力的特征；ΔH<0，ΔS<0是氫鍵和范德華力.

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)可看作是一常數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)公式：

lgK2/K1=(1/T1-1/T2)ΔH/R

(3)

ΔG=-RTInK

(4)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

(5)

求得ΔH、ΔS、ΔG，一并列于表1.

由表1的數(shù)據(jù)看出，不含F(xiàn)e3+離子時(shí)，F(xiàn)A-BSA體系的ΔH<0，ΔS>0，說(shuō)明FA與BSA之間以靜電力作用為主，該過(guò)程是熵增加、Gibbs自由能降低的自發(fā)超分子作用過(guò)程. 而Fe3+離子存在時(shí)，體系的ΔH<0，ΔS<0，表明FA和BSA主要以氫鍵和范德華力結(jié)合. 有/無(wú)Fe3+離子存在時(shí)FA與BSA之間作用力類型的改變，以及Fe3+離子參與時(shí)體系焓變?chǔ)的顯著減小，進(jìn)一步證明金屬Fe3+離子參與了FA與BSA的結(jié)合反應(yīng)[12].

c(FA) =1.13×10-6mol·L-1, c(Fe3+)/(10-5mol·L-1), 1-6:0, 1.71, 3.30, 5.00, 6.59, 8.28圖5 Fe3+對(duì)FA紫外吸收的影響Fig.5 Effect of Fe3+ on absorption spectra of FA

2.5 Fe3+與FA的紫外-可見(jiàn)光譜

為探明在FA與BSA的作用過(guò)程中Fe3+僅僅發(fā)揮了協(xié)同作用還是與FA形成了新的配合物而產(chǎn)生的影響. 采用紫外吸收光譜法進(jìn)一步探索了Fe3+與FA的結(jié)合. 從圖5可以看出Fe3+的加入使紫外吸收帶發(fā)生了藍(lán)移. 考慮到Fe3+離子也能和BSA結(jié)合，因此，金屬離子Fe3+可能同時(shí)與FA及BSA結(jié)合生成基態(tài)復(fù)合物，從而在FA與BSA之間起到“離子架橋”的作用[13].

3 結(jié)論

作者在生理?xiàng)l件下應(yīng)用熒光猝滅法和紫外-可見(jiàn)光譜法考查了人體內(nèi)常見(jiàn)的金屬離子Fe3+存在下，葉酸與BSA之間的相互作用. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)e3+存在時(shí)，葉酸對(duì)牛血清白蛋白的內(nèi)源性熒光仍具有猝滅作用，熒光猝滅機(jī)理均為靜態(tài)猝滅. 通過(guò)熱力學(xué)公式計(jì)算可知，不含F(xiàn)e3+離子時(shí)，F(xiàn)A與BSA之間以靜電力作用為主；而Fe3+離子存在時(shí)，F(xiàn)A和BSA主要以氫鍵和范德華力結(jié)合. 有/無(wú)Fe3+離子存在時(shí)FA與BSA之間作用力類型發(fā)生了改變. 通過(guò)對(duì)葉酸與Fe3+的紫外吸收光譜研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+與葉酸之間也有一定的作用.

參考文獻(xiàn)：

[1] MRC Vitamin Study Research Group. Prevention of neural tube defects:results of the medical research council vitamin study[J].Lancet,1991，338：131-137．

[2] GREEN R, JACOBSEN D W. Folate in health and dioase[M].New York: Marcel Dekker,1995：99-102．

[3] CARTER D C, HE X M.Struemm of human serum albumin[J].Science,1990，249(4966)：302-303．

[4] 張 勇，張貴珠，王月梅．光譜法研究絲裂霉素、血清白蛋白以及金屬離子間的相互作用[J]．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，16(6)：445-449．

[5] 劉慧娟，李 鵬，張亞?wèn)|，等．葉酸與人血清白蛋白結(jié)合作用的光譜研究[J]．光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(7)： 1915-1919．

[6] 白海鑫， 劉小花， 袁 超．人血清白蛋白與葉酸相互作用的熒光光譜法研究[J]．河南科學(xué)，2008，26(12)：1477-1480．

[7] 杜 娟．熒光法研究鹽酸多賽平與牛血清白蛋白的相互作用[J]．化學(xué)研究，2007，18(2)：66-68．

[8] 劉偉華，宋雙居，高書(shū)濤，等．大豆苷元與牛血清白蛋白的相互作用研究[J]．化學(xué)研究與應(yīng)用，2009，21(4)：496-500．

[9] ZHANG G C, WANG Y Q, ZHANG H M,et a1.Human serum albumin interaction with paraquat studied using spectroscopic methods[J].Pestic Biochem Physio,2007，87(1)：23-29．

[10] 馮素玲，袁道琴．阿魏酸哌嗪與牛血清白蛋白相互作用的研究[J]．分析試驗(yàn)室，2009，28(7)：78-82．

[11] ROSS D P, SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981，20(11)：3096-3102．

[12] 丁 飛，宋衛(wèi)堂，林 娟，等．鋅(Ⅱ)對(duì)于甲基百里酚藍(lán)與牛血清白蛋白相互作用的影響[J]．化學(xué)研究，2009，20(1)：57-60．

[13] XIA J L, DUBIN P L, YESOOK K. Complex formation between poly(oxyethylene)and sodium dodecyl sulfate micelles lights scattering,electrophoresis,and dialysis equilibrium studies[J]. J Phys Chem,1992，96(16)：6805-6811．