韓 勇

（山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原030031）

茯苓是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有滲濕、利尿、健脾等功效.茯苓多糖因具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制腫瘤生長(zhǎng)等功能，而成為近年來(lái)研究較多的真菌多糖.

為提高多糖的生物學(xué)活性，將天然多糖進(jìn)行硫酸酯化結(jié)構(gòu)修飾已成為多糖研究的熱點(diǎn)之一.眾多研究發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物學(xué)活性[1－3].

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)茯苓，獲得茯苓發(fā)酵液，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中含有大量茯苓菌絲體胞外多糖.目前，關(guān)于茯苓菌絲體胞外多糖硫酸酯化的研究報(bào)道較少，本文通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)研究了茯苓菌絲體胞外多糖硫酸酯化的工藝條件，為今后該多糖的生物學(xué)活性研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供實(shí)驗(yàn)用樣品

通過(guò)10L發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得茯苓發(fā)酵液，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中含有大量菌絲體胞外多糖.經(jīng)提取純化，得茯苓菌絲體胞外多糖.

1.2 主要儀器設(shè)備

752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），TGL20M－Ⅱ高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）.

1.3 茯苓菌絲體胞外多糖硫酸酯化條件的優(yōu)化

采用氯磺酸—吡啶法制備茯苓菌絲體胞外多糖硫酸酯衍生物.在冰浴及攪拌的條件下逐滴將氯磺酸緩慢滴入吡啶中，配制成硫酸酯化試劑.

稱取1g多糖溶于20mL甲酰胺，然后加入硫酸酯化試劑.反應(yīng)液水浴加熱至一定溫度，并持續(xù)攪拌反應(yīng)一定時(shí)間.反應(yīng)停止后冷卻至室溫，加入預(yù)冷的蒸餾水中，氫氧化鈉中和至中性，后加入3倍體積無(wú)水乙醇，析出沉淀.6 000r／min離心10min，收集沉淀，得茯苓菌絲體胞外多糖硫酸酯衍生物.

以硫酸基團(tuán)取代度為檢測(cè)指標(biāo)，考察氯磺酸與吡啶摩爾比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響.通過(guò)單因素試驗(yàn)找出試驗(yàn)因素水平范圍，經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳多糖硫酸酯化條件.

1.3.1 氯磺酸與吡啶摩爾比優(yōu)化試驗(yàn)

將氯磺酸與吡啶以不同的摩爾比配制成硫酸酯化試劑，按1.3所述進(jìn)行多糖硫酸酯化，其中，反應(yīng)液水浴加熱溫度為70℃，持續(xù)攪拌反應(yīng)3h.

1.3.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)

按1.3所述進(jìn)行多糖硫酸酯化，其中，分別調(diào)節(jié)反應(yīng)液水浴加熱溫度為50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃，持續(xù)攪拌反應(yīng)3h.

1.3.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)

按1.3所述進(jìn)行多糖硫酸酯化，分別持續(xù)攪拌反應(yīng)1h，2h，3h，4h，5h.

有了好的教育理念，還必須有好的頂層設(shè)計(jì)和一系列體制機(jī)制保障、數(shù)量質(zhì)量支撐。廣州市一方面把基礎(chǔ)教育發(fā)展和城市發(fā)展目標(biāo)緊密結(jié)合，廣州的教育要為廣州的發(fā)展提供強(qiáng)有力的智力支持和人才儲(chǔ)備，一方面把教育作為廣州民生工程、民心工程和社會(huì)與諧建設(shè)之首，打出了宏微兼顧、巨細(xì)結(jié)合、系統(tǒng)掘進(jìn)的“組合拳”。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多糖硫酸酯化條件進(jìn)一步優(yōu)化，運(yùn)用響應(yīng)面分析確定影響因素的最佳條件.

1.4 硫酸基團(tuán)取代度檢測(cè)

采用硫酸鋇濁度法測(cè)定硫酸基團(tuán)含量（S%），硫酸基團(tuán)取代度（degree of substitution，Ds）按公式:Ds＝l.62×S%／（32－l.02×S%）計(jì)算[4].

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖硫酸酯化單因素試驗(yàn)

2.1.1 氯磺酸與吡啶摩爾比優(yōu)化試驗(yàn)

以硫酸基團(tuán)取代度為檢測(cè)指標(biāo)，考察氯磺酸與吡啶以不同的摩爾比配制成的硫酸酯化試劑對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 氯磺酸與吡啶摩爾比對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響

由表1結(jié)果可知，增加氯磺酸的比例，多糖可充分獲得硫酸基，從而取代度明顯提高，比例為1∶4時(shí)，取代度最高為1.02.當(dāng)繼續(xù)增加氯磺酸的比例，取代度反而有所降低，推測(cè)可能是反應(yīng)液中酸度過(guò)高，導(dǎo)致了硫酸基的水解.

將氯磺酸與吡啶以1∶4的摩爾比配制成硫酸酯化試劑，按1.3所述進(jìn)行多糖硫酸酯化，以硫酸基團(tuán)取代度為檢測(cè)指標(biāo)，考察不同反應(yīng)溫度對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 反應(yīng)溫度對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響

由表2結(jié)果可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，硫酸基團(tuán)取代度明顯提高，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)70℃后，硫酸基團(tuán)取代度開(kāi)始下降.升高溫度有利于硫酸酯化反應(yīng)的充分進(jìn)行，但溫度升高超過(guò)一定程度后，多糖可能被降解，酯化反應(yīng)受到抑制，從而硫酸基團(tuán)取代度下降.因此確定反應(yīng)溫度為70℃.

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)

將氯磺酸與吡啶以1∶4的摩爾比配制成硫酸酯化試劑，反應(yīng)液水浴加熱至70℃，按1.3所述進(jìn)行多糖硫酸酯化，以硫酸基團(tuán)取代度為檢測(cè)指標(biāo)，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖硫酸酯化效果的影響

由表3結(jié)果可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，硫酸基團(tuán)取代度明顯提高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)3h后，硫酸基團(tuán)取代度開(kāi)始下降.因此，確定反應(yīng)時(shí)間為3h.

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化多糖硫酸酯化條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氯磺酸與吡啶摩爾比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為自變量，硫酸基團(tuán)取代度為響應(yīng)值，對(duì)多糖硫酸酯化條件進(jìn)行Box－Behnken優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表5，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表6.

表4 Box－Behnken設(shè)計(jì)因素水平表

表5 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表

表6 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

運(yùn)用Design Expert軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸方程:Y＝1.012＋0.053 75A＋0.06B＋0.118 75C＋0.05AB－0.042 5AC＋0.015BC－0.129 75A2－0.137 25B2－0.169 75C2.回歸方程的決定系數(shù)R2為0.982 0，說(shuō)明回歸方程的擬合程度很好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性.回歸模型顯著可靠（P＜0.000 1），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明可以利用該回歸方程確定最優(yōu)的多糖硫酸酯化條件.

根據(jù)回歸方程，作出不同因子的響應(yīng)面分析圖，見(jiàn)圖1.響應(yīng)面分析圖直觀的反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響.

圖1 各因素交互作用的響應(yīng)面分析圖

由圖1可知擬合曲面有最大值，通過(guò)嶺脊分析[5]，得到最大值所對(duì)應(yīng)的各因素的編碼值:A＝0.204 8，B＝0.275 2，C＝0.336 6，通過(guò)Design Expert軟件求解方程，得出多糖硫酸酯化優(yōu)化的條件為:氯磺酸與吡啶摩爾比0.26即為1∶3.85，反應(yīng)溫度72.75℃，反應(yīng)時(shí)間3.34h.該模型預(yù)測(cè)的取代度為1.05.考慮到實(shí)際操作，將硫酸酯化的最優(yōu)條件修正為氯磺酸與吡啶摩爾比1∶3.85，反應(yīng)溫度73℃，反應(yīng)時(shí)間3.34h.

2.3 Box－Behnken回歸模型驗(yàn)證

為檢驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用修正后的最優(yōu)酯化條件進(jìn)行多糖硫酸酯化驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，測(cè)得取代度為1.02，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，表明兩者之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠.

3 結(jié)論

近年來(lái)，多糖的分子修飾和結(jié)構(gòu)改造成為研究的熱點(diǎn)，其中，硫酸酯化多糖以其諸多的生物和藥理作用愈來(lái)愈引起人們的重視.但在硫酸酯化多糖的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，其硫酸酯化工藝條件的優(yōu)化是關(guān)鍵.

本實(shí)驗(yàn)采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化了茯苓菌絲體胞外多糖硫酸酯化的工藝條件，優(yōu)化后的工藝參數(shù)為:氯磺酸與吡啶摩爾比1∶3.85，反應(yīng)溫度73℃，反應(yīng)時(shí)間3.34h.

[1]魏建經(jīng)，邵樹軍，王天元.硫酸酯化多糖化學(xué)及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，1999，20（5）:260－262

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[4]Dodgson K S，Price R G.A note on the determination of ester sulfate content of sulphated polysaccharides[J].Biochem J，1962，84（1）:106－110

[5]曹小紅，蔡 萍，李 凡，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus natto TK－1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國(guó)生物工程雜志，2007，27（4）:59－65