祁媛媛 姜 茜 陳 超 曹 云 錢莉玲

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一類具有自我更新和高度增殖能力的血管前體細(xì)胞，可以在某些病理因素的刺激下由骨髓動員至外周血循環(huán)中，參與血管重建和新生［1］。同時，EPCs還可以釋放相關(guān)因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)等，從而促進(jìn)血管生成、減少凋亡，一些生長因子如VEGF等可以促進(jìn)EPCs的動員。成人的研究顯示，骨髓來源的EPCs可促進(jìn)缺血及血管損傷組織的血管修復(fù)，在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征、心血管疾病等中均起重要作用［2，3］。有文獻(xiàn)報道嚴(yán)重視網(wǎng)膜黃斑退化的患者外周血CD34+細(xì)胞的數(shù)量減少，內(nèi)皮集落形成能力減弱［4］。近來年，EPCs在早產(chǎn)兒血管異常中的作用也越來越受到關(guān)注［5～7］。

Balasubramaniam等［8］發(fā)現(xiàn)高氧使新生小鼠 EPCs降低，從而使肺血管生長受損，肺泡生長障礙。晚近的臨床研究顯示發(fā)生BPD的早產(chǎn)兒出生時的臍血EPCs集落數(shù)減少［9，10］，提示出生時 EPCs減少可能參與了 BPD的發(fā)生。然而，另一項研究未發(fā)現(xiàn)出生時外周血EPCs與BPD發(fā)生的相關(guān)性［11］。這些結(jié)果的差異提示臍血并不能代表外周血EPCs的水平，因為生后外周血EPCs水平受氧、炎癥損傷等多種因素的影響。而目前仍無研究系統(tǒng)地評估EPCs在早產(chǎn)兒并發(fā)癥中的作用。那么，EPCs在早產(chǎn)兒相關(guān)并發(fā)癥中的作用究竟如何?本研究分析生后不同時點EPCs的動態(tài)變化，及其與不同早產(chǎn)并發(fā)癥的相關(guān)性。

1 方法

1.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①2011年7月至2012年4月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)NICU住院的、胎齡＜32周的、出生體重＜1 500 g的和生后6h內(nèi)入我院的新生兒，并排除未取得知情同意的、病情不穩(wěn)定的和存在明顯先天畸形者。1.2 數(shù)據(jù)剔除標(biāo)準(zhǔn) 觀察結(jié)束后數(shù)據(jù)分析時，剔除染色體畸形、青紫型先天性心臟病、慢性宮內(nèi)缺氧、換血治療、敗血癥、放棄治療出院或死亡等病例的數(shù)據(jù)。

1.3 診斷、分組和倫理BPD組:糾正胎齡36周仍需氧療維持正常氧合，X線胸片顯示雙肺不同程度的肺紋理增多模糊或毛玻璃影、囊泡形成、線狀及網(wǎng)格狀影;ROP組:參照ROP國際標(biāo)準(zhǔn)(ICROP)診斷［12］;IVH組:通過頭顱B超或頭顱影像學(xué)檢查診斷;對照組:未發(fā)現(xiàn)BPD、ROP和IVH的住院早產(chǎn)兒。本研究方案獲得我院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.4 標(biāo)本收集及處理

1.4.1 標(biāo)本采集 于出生時，生后7、14、21和28d及糾正胎齡36周時，取臨床必要的抽血檢查的剩余動脈抗凝血標(biāo)本。1.4.2 外周血EPCs檢測 用流式細(xì)胞分析儀檢測外周血EPCs水平。取外周血100μL，分別加入10μL CD34-FITC抗體(美國 BD 公司)、10μL KDR-PE 抗體(R＆D 公司)和CD133-APC(Meltenyi公司)抗體，同時對照管加入100μL標(biāo)本，分別加入CD34、CD133和KDR同型對照抗體，室溫避光孵育20 min。加入1mL溶血素溶解紅細(xì)胞，離心后加入去離子水待檢測。采用不同的表面分子組合CD34+KDR+、KDR+CD133+、CD34+KDR+CD133+細(xì)胞代表EPCs水平，CD34+、CD133+細(xì)胞代表骨髓來源的干/祖細(xì)胞水平。

1.4.3 血漿SDF-1、VEGF和GM-CSF檢測 參照SDF-1、VEGF和GM-CSF因子ELISA試劑盒(R＆D公司)說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。連續(xù)變量采用±s表示，組間比較采用t檢驗，非連續(xù)變量用計數(shù)或率表示，率的比較采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗。(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間101例極低出生體重兒符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)數(shù)據(jù)剔除標(biāo)準(zhǔn)檢驗后，最終68例極低出生體重早產(chǎn)兒進(jìn)入本文分析(圖1)。

圖1 研究對象納入和排除流程圖Fig 1 Flow chart of including and excluding procedure of study subjects

平均胎齡(29.3±1.6)周，平均出生體重(1 246±228)g。BPD組20例，ROP組10例，IVH組8例，對照組30例。BPD組、ROP組和IVH組的胎齡、出生體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但BPD組、ROP組的胎齡均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 4 組患兒的基線資料［±s，M(range)，n(%)］Tab 1 Baseline characteristics of infants in four groups［ ± s，M(range)，n(%)］

表1 4 組患兒的基線資料［±s，M(range)，n(%)］Tab 1 Baseline characteristics of infants in four groups［ ± s，M(range)，n(%)］

Notes GA:gestational age;BW:birth weight;PROM:premature rupture of membranes;BPD:bronchopulmonary dysplasia;ROP:retinopathy of prematurity;IVH:intraventricular hemorrhage.BPD vs control(GA，P=0.000，BW，P=0.000，Apgar score，P=0.005);ROP vs control(GA，P=0.016);IVH vs control(BW，P=0.023).Other variables had no siginificant difference between ROP，BPD，IVH and control groups

Parameters GA/week BW/g 5 min Apgar scorePROM Male BPD(n=20)28.4±1.7 1 138±214 7(3-10)3(16.0)11(55.0)ROP(n=10)28.9±1.3 1 297±154 8(3-10)3(30.0)5(50.0)IVH(n=8)29.1±1.6 1 153±235 7(5-9)1(16.7)3(50.0)Control(n=30)30.3±1.4 1 389±256 9(5-10)4(13.3)19(63.3)

2.2 BPD組和對照組外周血EPCs水平比較 圖1顯示，BPD組和對照組出生時點CD34+細(xì)胞水平均最高，7d時點明顯下降。與7d時點相比，CD34+細(xì)胞水平在隨后的不同時點中有輕微的下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。出生時點BPD組和對照組WBC計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(12.7±8.1)×109·L-1vs(9.3±6.5)×109·L-1，P=0.153。BPD組與對照組出生時點EPCs水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。生后 7d時點 CD34+KDR+、KDR+CD133+及CD34+KDR+CD133+EPCs水平BPD組均較對照組明顯降低，CD34+KDR+:(0.019 ±0.009)% vs(0.026±0.012)%，KDR+CD133+:(0.004±0.002)%vs(0.008±0.004)%，CD34+KDR+CD133+:(0.005±0.002)%vs(0.008±0.004)%;P均＜0.05。生后14d時點EPCs水平BPD組較對照組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。生后21d時點的CD34+KDR+細(xì)胞水平BPD組也較對照組下降，(0.016±0.010)%vs(0.023±0.012)%，(P＜0.05)。在生后28d和糾正胎齡36周時點兩組EPCs水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 BPD、ROP、IVH與對照組患兒生后不同時點外周血EPCs比較Fig 2 Comparisons of circulating EPCs among control，BPD，ROP and IVH infants atdifferent time points

表2顯示，從出生至生后21d時點，VEGF水平BPD組均較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各觀察時點SDF-1和GM-CSF水平BPD組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 ROP組和對照組外周血EPCs比較 圖1顯示，出生時CD34+、CD133+細(xì)胞水平ROP組較對照組顯著升高，CD34+:(0.970±0.551)%vs(0.667±0.323)%，CD133+:(1.466±0.693)%vs(0.207±0.306)%;P均＜0.05。出生時 CD34+KDR+、KDR+CD133+和 CD34+KDR+CD133+EPCs細(xì)胞水平在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。生后7d時點，CD34+和CD133+細(xì)胞及EPCs水平兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。生后14、21和28d時點ROP組與對照組外周血EPCs水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在糾正胎齡36周時，外周血KDR+CD133+EPCs和CD34+KDR+CD133+EPCs水平ROP組較對照組有升高的趨勢，KDR+CD133+:(0.010±0.003)%vs(0.007±0.003)%，P=0.053;CD34+KDR+CD133+:(0.009±0.005)% vs(0.006± 0.003)%，P=0.061。

2.4 IVH組和對照組外周血EPCs比較 圖1顯示，出生時CD34+細(xì)胞水平和EPCs細(xì)胞水平IVH組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在生后7d時點，ICD34+、CD133+和CD34+CD133+細(xì)胞水平IVH組較對照組明顯升高，CD34+:(0.642±0.323)% vs(0.370±0.137)%，CD133+:(0.516±0.289)%vs(0.277± 0.103)%，CD34+CD133+:(0.499±0.283)%vs(0.235±0.113)%;P均＜0.05;而EPCs水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在隨后的各觀察時點兩組的EPCs水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 細(xì)胞因子在BPD組與對照組不同時點比較±s)Tab 2VEGF，SDF-1，and GM-CSFplasma concentrations in control and BPD infants±s)

表2 細(xì)胞因子在BPD組與對照組不同時點比較±s)Tab 2VEGF，SDF-1，and GM-CSFplasma concentrations in control and BPD infants±s)

Notes BPD:bronchopulmonarydysplasia;VEGF:vascular endothelial growth factor;SDF-1:stromal cell-derived factor-1;GM-CSF;granulocytemacrophage colony-stimulating factor

Group 0d 7d 14d 21d 28d VEGF/pg·mL-1 BPD 198.2±156.4 394.3±127.9 400.8±78.9 287.4±163.9502.8±202.8 Control 768.6±445.2 741.1±434.5 602.0±240.1 648.5±412.5 534.8±307.4 P 0.040 0.028 0.031 0.043 0.895 SDF-1/ng·mL-1 BPD 2.0±1.2 2.3±0.8 2.7±0.9 2.9±0.8 2.6±0.6 Control 3.1±0.7 3.3±0.4 3.3±0.7 3.6±0.8 2.9±0.7 P 0.180 0.191 0.236 0.168 0.268 GM-CSF/ng·mL-1 BPD 1.6±1.5 2.6±1.8 2.2±0.8 2.5±1.3 1.9±1.1 Control 2.9±0.5 4.5±1.5 2.8±1.5 4.0±2.4 3.2±2.8 P 0.157 0.138 0.415 0.1360.094

3 討論

EPCs在血管的生成、維持和修復(fù)中均起重要的作用，多項研究顯示EPCs參與了血管性疾病的發(fā)生。本文采用流式細(xì)胞儀檢測外周血EPCs的水平。值得注意的是，目前國際上對EPCs的定義及檢測方法仍未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。通常采用的方法包括細(xì)胞培養(yǎng)集落計數(shù)和流式細(xì)胞儀檢測。這兩種方法的檢測結(jié)果可能不一致［13］。細(xì)胞培養(yǎng)需要在外界環(huán)境中培養(yǎng)一定的時間，且不能完全反映體內(nèi)的生物學(xué)特性;而流式細(xì)胞儀通過檢測細(xì)胞的表面抗原快速評價EPCs水平，更適于臨床應(yīng)用。目前常用的檢測EPCs的表面標(biāo)記包括CD34、KDR和CD133，每種標(biāo)記可能代表了EPCs分化的不同階段［14，15］。本研究采用了3種標(biāo)記的組合 CD34+KDR+、KDR+CD133+和 CD34+KDR+CD133+代表EPCs水平。

EPCs與BPD發(fā)生的相關(guān)性近年來的研究顯示了不同的結(jié)果。Borghesi等［9］發(fā)現(xiàn)出生時臍血EPCs集落和外周血EPCs水平低的患兒發(fā)生BPD的風(fēng)險增加。而Paviotti等［11］研究顯示出生時流式細(xì)胞儀檢測的EPCs水平與BPD的發(fā)生不相關(guān)。與以上結(jié)果不同，一項晚近的研究發(fā)現(xiàn)出生時EPCs水平高的患兒易發(fā)生BPD，但該研究未排除胎齡的影響［16］。本研究未發(fā)現(xiàn)出生時EPCs水平與BPD發(fā)生的關(guān)系，但BPD組胎齡顯著低于對照組。目前已證實胎齡與生后尤其是48h內(nèi)的祖細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)［17］，這可能是兩組EPCs未發(fā)現(xiàn)差異的原因。本研究發(fā)現(xiàn)BPD組生后7d時點的EPCs水平較對照組明顯下降，這在既往文獻(xiàn)中未見報道。提示生后早期EPCs水平降低可能參與了早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生。

VEGF信號通路在生后早期血管和肺泡發(fā)育中起重要的作用［18，19］。動物研究顯示新生兒期阻斷VEGF受體會造成肺結(jié)構(gòu)破壞，產(chǎn)生與 BPD病理相同的表現(xiàn)［20，21］。同時，VEGF還是重要的EPCs動員調(diào)節(jié)因子［22］。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BPD組血漿VEGF水平從出生到生后21d均明顯降低。由此推測VEGF的降低是導(dǎo)致EPCs降低及肺血管發(fā)育異常的原因。然而，VEGF降低的機(jī)制及與EPCs降低的因果關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

ROP的發(fā)生與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的發(fā)育異常密切相關(guān)。在本研究中，ROP組出生時骨髓來源的循環(huán)干/祖細(xì)胞較對照組明顯升高，與以往的研究結(jié)果一致［9］。然而，ROP組胎齡明顯低于對照組，可能是循環(huán)CD34+細(xì)胞增高的原因。有研究顯示，發(fā)生ROP的早產(chǎn)兒生后10周外周血EPCs水平顯著高于未發(fā)生ROP的患兒［23］。本研究中出生時、生后7～28d均未發(fā)現(xiàn)ROP組和對照組患兒EPCs水平的差異，但在糾正胎齡36周時ROP組外周血EPCs有高于對照組患兒的趨勢，與以往研究結(jié)果相似。但EPCs的動態(tài)變化在ROP發(fā)生中的作用及機(jī)制仍需深入研究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)生后7d時點IVH組CD34+細(xì)胞水平升高，這可能與出血、血管損傷促進(jìn)骨髓干/祖細(xì)胞動員有關(guān)。EPCs在IVH的作用仍不確定，需進(jìn)一步的研究。

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