張 煒， 應(yīng)春妹

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200127)

侵襲性念珠菌引起的深部真菌感染的上升，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題［1］。隨著免疫抑制劑在臨床的廣泛使用，免疫缺陷人群的增多尤其是獲得性免疫缺陷綜合征患者的增加，目前白念珠菌在臨床的分離率有所下降，而非白念珠菌，尤其是光滑念珠菌等引起的感染明顯增加［2］。由于光滑念珠菌對(duì)常用抗真菌藥物包括兩性霉素B的敏感性低，且對(duì)三唑類抗真菌藥物的最低抑菌濃度值偏高，可對(duì)三唑類藥物原發(fā)耐藥，也可出現(xiàn)繼發(fā)耐藥。耐藥的發(fā)生是一個(gè)多水平、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥機(jī)制的研究已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)目前在念珠菌耐藥性尤其是光滑念珠菌耐藥性方面的研究仍然較少。因此，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對(duì)光滑念珠菌臨床分離株ERG11、CDR1和CDR2基因表達(dá)的mRNA進(jìn)行相對(duì)定量，從而探討基因表達(dá)與耐藥之間的關(guān)系。

材料和方法

一、材料

1.試驗(yàn)菌株 光滑念珠菌臨床菌株共22株，其中對(duì)氟康唑耐藥11株(編號(hào)分別為NSG-1、DF-1、DF-2、DF-3、DF-5、DF-7、DF-8、DF-10、DF-17、DF-18、DF-20)、劑量依賴性敏感 3 株(EME-1、SUR-2、SIC-1)、敏感 8 株(NSG-7、NSG-3、NSG-4、SUR-1、RES-2、WFF-1、SIC-2、OST-1)，均由仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科鑒定并保存。試驗(yàn)菌株藥物敏感性分析方法及結(jié)果判定參考文獻(xiàn)［3］。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌(ATCC 22019)和克柔念珠菌(ATCC 6258)，由瑞金醫(yī)院盧灣分院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

2.主要試劑與儀器 Trizol試劑 (美國(guó)Invitrogen公司);DEPC(北京鼎國(guó)昌盛公司);氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(上?；瘜W(xué)試劑公司);反轉(zhuǎn)錄試劑 (美國(guó) Fermentas公司);Realtime試劑(瑞士Roche公司);RNA free水 (日本Takara公司);熒光定量PCR儀 (美國(guó)ABI公司);核酸蛋白分析儀 (德國(guó)Eppendorf公司)。

3.引物 擴(kuò)增光滑念珠菌 CDR1、CDR2、ERG11基因以及actin編碼基因(ACT1)的引物均使用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。所有引物均由Invitrogen公司合成。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物

二、方法

1.試驗(yàn)菌株總RNA提取 首先挑取活化后的單個(gè)菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度至(5～10)×106個(gè)/mL;再取1mL菌液離心收集細(xì)胞，用焦碳酸二乙酯水洗滌2次;然后按照Trizol試劑說(shuō)明提取試驗(yàn)菌株總RNA，最后加入適當(dāng)體積30～50μL RNA free水，充分溶解。取適量樣本1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，并分別取1μL樣本測(cè)定吸光度(A)260nm/A280nm值，其余分裝，－70℃保存。

2.逆轉(zhuǎn)錄PCR 在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，先采用11μL總體積(10×緩沖液1μL;脫氧核糖核酸酶1μL;RNA樣本4μg;RNA free水補(bǔ)足至11μL)，37℃ 30 min;然后加入終止緩沖液(Stop solution)和胸腺嘧啶寡聚核苷酸Oligo(dt)各1μL，75℃ 5 min，冰上退火5 min，離心2～3 s;最后加入5*Moloney小鼠白血病病毒緩沖液5μL，dNTP5μL，核糖核酸酶抑制劑1μL，Moloney小鼠白血病病毒1μL，總體積25μL，42℃1h，70℃ 10min，冰上退火得cDNA。

3.實(shí)時(shí)PCR PCR反應(yīng)體系(25μL):SYBR Green PCR預(yù)混液12.5μL、引物(10μmol/L)各2.5μL、cDNA 模板 2.5 μL、dH2O5.0μL。反應(yīng)條件:50℃2min，95℃10min;95℃15s，60℃60s，共40個(gè)循環(huán)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每一樣本重復(fù)3次，求其平均Ct值(即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。依據(jù)Livak等［4］設(shè)計(jì)的一種比較閾值法來(lái)測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因的量表示的是試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)與對(duì)照組的變化倍數(shù)。

通過(guò)R(2.15.2)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(M)和四分位數(shù)(P25～P75)表示，用W:lcoxon軼和檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物的確定分析

紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260和280 nm波長(zhǎng)A值，A260nm/A280nm均在1.8～2.0，且RNA電泳結(jié)果顯示 RNA完整性好，說(shuō)明所提取真菌RNA質(zhì)量較好。ERG11、CDR1、CDR2以及 ACT1基因均可見(jiàn)擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線，溶解曲線為單一波峰、形狀銳利，說(shuō)明試驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

二、耐藥組與敏感組多個(gè)耐藥基因mRNA表達(dá)水平差異

將22株臨床光滑念珠菌分為耐藥組、劑量依賴性敏感組和敏感組，不同組 CDR1、CDR2和ERG11基因mRNA表達(dá)差異見(jiàn)表2和圖1～3。CDR1基因在耐藥組與敏感組以及劑量依賴性敏感組與敏感組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(W=88、24，P均＜0.01);CDR2基因在耐藥組與敏感組以及劑量依賴性敏感組與敏感組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(W=71、24，P均＜0.05);ERG11 基因在耐藥組與敏感組以及劑量依賴性敏感組與敏感組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(W=82、24，P均＜0.05)。

表2 不同組CDR1、CDR2和ERG11基因mRNA表達(dá)的差異 ［M(P25～P75)］

圖1 光滑念珠菌耐藥組、劑量依賴性敏感組及敏感組CDR1基因表達(dá)量比較

圖2 光滑念珠菌耐藥組、劑量依賴性敏感組及敏感組CDR2基因表達(dá)量比較

圖3 光滑念珠菌耐藥組、劑量依賴性敏感組及敏感組ERG11基因表達(dá)量比較

討 論

由于獲得性免疫缺陷綜合征發(fā)病率增高，免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物和糖皮質(zhì)激素的大量應(yīng)用，器官移植術(shù)、外科侵襲性操作及腫瘤放化療的不斷發(fā)展，使得深部真菌感染發(fā)病率不斷升高。目前光滑念珠菌已成為僅次于白念珠菌之后居于第2位的常見(jiàn)真菌感染病原體，且由于光滑念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥物的最低抑菌濃度值趨于更高，且有些光滑念珠菌對(duì)抗真菌藥物存在固有的低敏感率，包括兩性霉素B［5］，造成感染后治療相當(dāng)困難。Borst等［6］研究表明即使事先未使用唑類藥物治療，光滑念珠菌也會(huì)由于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增高而導(dǎo)致耐藥。

導(dǎo)致臨床光滑念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥物耐藥的機(jī)制主要有:(1)唑類藥物作用的靶酶即羊毛甾醇14α-去甲基酶增加，導(dǎo)致三唑類藥物在光滑念珠菌細(xì)胞內(nèi)必須有更高的濃度才能發(fā)揮其阻斷靶酶合成的作用;(2)藥物與羊毛甾醇14α-去甲基酶親和力下降;(3)真菌細(xì)胞內(nèi)藥物外排能力增強(qiáng)而導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)無(wú)法積聚藥物，而與光滑念珠菌耐藥密切相關(guān)的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是Cdr1p和Cdr2p，分別由CDR1和CDR2編碼;(4)因固醇Δ5，6-脫氫酶失活造成麥角固醇生物合成途徑失活。

部分試驗(yàn)研究結(jié)果提示，CDR1、CDR2及ERG11的過(guò)度表達(dá)與光滑念珠菌耐藥性形成有關(guān)。本研究對(duì)該3種基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量，發(fā)現(xiàn)耐藥菌株 CDR1、CDR2及ERG11基因的mRNA表達(dá)量均高于敏感株，且隨著對(duì)氟康唑耐藥程度增加而增加，提示試驗(yàn)菌株CDR1、CDR2及ERG11基因表達(dá)上調(diào)可能是本研究中光滑念珠菌臨床分離株對(duì)氟康唑耐藥的主要分子機(jī)制。這與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［7］。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)CDR1的表達(dá)水平明顯高于CDR2，提示不同基因在耐藥性形成中地位不同，CDR2基因在本研究所用菌株耐藥性形成中的作用較CDR1基因小，這與國(guó)外的研究結(jié)果一致。Sanglard等［8］研究發(fā)現(xiàn)敲除光滑念珠菌CDR2基因未導(dǎo)致其對(duì)唑類藥物敏感性的增加，而同時(shí)敲除CDR1和CDR2可使光滑念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性上升50%并且不會(huì)出現(xiàn)耐氟康唑的突變株。因此，CDR2可能是依賴于CDR1發(fā)揮作用的，但本試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)CDR1基因表達(dá)而CDR2不表達(dá)的情況。

綜上所述，光滑念珠菌CDR1、CDR2及ERG11基因的過(guò)表達(dá)是臨床分離菌株對(duì)氟康唑耐藥的主要分子機(jī)制，但光滑念珠菌耐藥的形成是一個(gè)多因素作用、多水平調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，單個(gè)耐藥基因或單一耐藥機(jī)制均不能完全解釋光滑念珠菌的所有耐藥現(xiàn)象，尚待在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

［1］龔曉霖，儲(chǔ)怡星，范基農(nóng)，等.真菌感染及其藥敏試驗(yàn)方法［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2005，20(1):81-83.

［2］Pfaller MA，Messer SA，Boyken L，etal.Geographic variation in the susceptibilities of invasive isolates of Candida glabrata to seven systemically active antifungal agents:a global assessment from the ARTEMIS Antifungal Surveillance Program conducted in 2001 and 2002［J］.J Clin Microbiol，2004，42(7):3142-3146.

［3］鄭 冰，姚冬婷，應(yīng)春妹，等.醫(yī)院感染光滑念珠菌耐藥性及流行病學(xué)分析［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(6):461-466.

［4］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［5］Lockhart SR，Joly S，Pujol C，etal.Development and verification of fingerprinting probes for Candida glabrata［J］.Microbiology，1997，14(Pt 12):3733-3746.

［6］Borst A，Raimer MT，Warnock DW，etal.Rapid acquisition of stable azole resistance by Candida glabrata isolates obtained before the clinical introduction of fluconazole［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):783-787.

［7］Niimi M，Nagai Y，Niimi K，etal.Identification of two proteins induced by exposure of the pathogenic fungus Candida glabrata to fluconazole［J］. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，782(1-2):245-252.

［8］Sanglard D，Ischer F，Bille J.Role of ATP-bindingcassette transporter genes in high-frequency acquisition of resistance to azole antifungals in Candida glabrata［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(4):1174-1183.