顧 萍，王 靜，張 帆，姚如恩，傅啟華

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海200127)

血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa，又稱(chēng)整合素αⅡbβ3，是血小板(PLT)膜上含量最多的膜糖蛋白，通常以復(fù)合物形式分布于PLT和巨核細(xì)胞表面，是PLT膜的主要受體。GPⅡb/Ⅲa基因的多態(tài)性構(gòu)成不同的PLT血型，是造成PLT輸注無(wú)效的免疫性因素。

材料和方法

一、對(duì)象

98例單采PLT輸注患者均來(lái)自上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液腫瘤科，2010年8月至2011年10月的血液病治療期間共輸注單采PLT 1 468袋，均為輸注單采PLT 3次以上且歷時(shí)半年以上。其中男59例，女39例，年齡5個(gè)月～16歲。患者來(lái)源為全國(guó)各地，江蘇、浙江、上海地區(qū)占大多數(shù)。對(duì)照組30例，均為非血液病患者，因PLT減少或術(shù)中輸注單采PLT 2次以下。

二、方法

1.標(biāo)本采集 采集患者靜脈血標(biāo)本，以0.109 mol/L檸檬酸鈉1∶9抗凝。標(biāo)本為分2份，1份用于PLT抗體檢測(cè)，分離血漿于－20℃凍存，1周內(nèi)檢測(cè)完畢;另 1份用于抽提 DNA，－80℃凍存。

2.單采PLT來(lái)源 單采PLT由上海市血液中心提供。使用Haemonetics MCS+全自動(dòng)血液成份分離機(jī)采集健康獻(xiàn)血者PLT。每單位PLT容量約250 mL，含 PLT 約2.5×1011個(gè)。

3.試劑與儀器 TIANamp Blood DNA Kit試劑盒由北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。引物設(shè)計(jì)參照 NCBI GenBank中 GPⅡb/Ⅲa基因(ITGA2B和ITGB)序列(序列號(hào) NG008331)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑由TaKaRa公司(大連寶生物)生產(chǎn)。PLT抗體檢測(cè)試劑盒(固相凝集法)及專(zhuān)用離心機(jī)由長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。PLT計(jì)數(shù)采用SYSMEX XS-800i全自動(dòng)血液分析儀，配套試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品等均由Sysmex公司生產(chǎn)。

表1 GPⅡb/Ⅲa上的PLT抗原擴(kuò)增引物序列

4.GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，提取患者基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)總體積 25μL，包括患者 DNA 1 μL、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、10× 緩沖液2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、H2O 17.25 μL。擴(kuò)增條件:95℃ 5 min，然后95℃變性30 s，56～62℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶(上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)純化后直接測(cè)序，所用儀器型號(hào)為ABI 3730 DNA測(cè)序儀。

5.PLT特異性及相關(guān)性抗體檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用固相凝集法檢測(cè)患者血漿中IgG型PLT抗體。

6.PLT輸注指征 患者PLT減少，有顱內(nèi)出血、體表有出血點(diǎn)、紫癜、鼻衄、齦血、血尿、消化道出血等出血癥狀或/和PLT計(jì)數(shù)＜20×109/L伴或不伴出血癥狀。

7.PLT輸注療效評(píng)價(jià) 本研究采用輸注后24h PLT計(jì)數(shù)糾正增加指數(shù)(corrected count increment，CCI)作為評(píng)判依據(jù)。CCI=絕對(duì)增加數(shù)×體表面積/輸入PLT總數(shù)。輸注后24h CCI＞4.5為輸注有效，否則為輸注無(wú)效。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)。采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)所有患者的GPⅡb的E26和GPⅢa的E3、E4、E10、E12 外顯子進(jìn)行測(cè)序分析，并與Genbank(序列號(hào)NG008331)相比對(duì)，結(jié)果除GPⅡb的E26存在T18809G的變異外，其他外顯子未發(fā)現(xiàn)變異。T18809G變異導(dǎo)致Ⅱb基因編碼843位的異亮氨酸為絲氨酸所取代，產(chǎn)生I843S(Ile843Ser)多態(tài)性。此多態(tài)性形成了PLT特異性抗原(human platelet antigen，HPA)-3血型的3種基因型，即 HPA-3aa、HPA-3ab、HPA-3bb(圖1)。3種基因型的例數(shù)分別為31、46、21例。

圖1 HPA-3基因多態(tài)性產(chǎn)生的3種血小板血型

二、PLT特異性及相關(guān)性抗體檢測(cè)結(jié)果

PLT抗體包括由PLT HPA產(chǎn)生的PLT特異性抗體和由HLA、紅細(xì)胞抗原等共同抗原產(chǎn)生的相關(guān)性抗體。患者組PLT抗體陽(yáng)性率為52.0%，明顯高于對(duì)照組(13.3%，P＜0.01)，見(jiàn)表2。說(shuō)明PLT抗體在多次輸注PLT的血液科患者中明顯升高。3種HPA-3基因型之間PLT抗體陽(yáng)性率無(wú)差異(P＞0.05)，說(shuō)明HPA-3 3種基因型患者在多次輸注PLT后都會(huì)產(chǎn)生PLT抗體，相互間無(wú)區(qū)別。見(jiàn)表3。

表2 PLT抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 3種HPA基因型產(chǎn)生PLT抗體的比較

三、PLT輸注效果評(píng)價(jià)

1 468袋PLT中有1 142袋輸注后24h CCI＞4.5，有效率為77.8%。PLT輸注的有效性在HPA-3的3個(gè)基因型中無(wú)明顯差異(P＞0.05)，其中HPA-3ab略高，見(jiàn)表4。對(duì)51例存在PLT抗體的患者中的21例做了PLT配合性輸注，共輸注單采 PLT 65袋，有效輸注54次，有效率為83.1%。

表4 PLT輸注療效在HPA-3基因型中的比較

討 論

PLT GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物是由α和β以非共價(jià)鍵結(jié)合而組成的異二聚體蛋白，其編碼基因ITGA2B和ITGB3均位于染色體17q21～22上，以常染色體雙等位基因以共顯性模式控制。GPⅡb基因(ITGA2B)長(zhǎng)17.2 Kb，含30個(gè)外顯子，編碼1 039個(gè)氨基酸。GPⅢa基因(ITGB3)長(zhǎng)度為46 Kb，屬于單拷貝基因，含15個(gè)外顯子，編碼778個(gè)氨基酸。GPⅡb和GPⅢa上均有很高的多態(tài)性，除HPA-14w外，絕大多數(shù)是由相應(yīng)PLT GP結(jié)構(gòu)基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)引起，其多態(tài)性構(gòu)成了人類(lèi)PLT HPA，并表現(xiàn)為PLT獨(dú)特的遺傳多態(tài)性。

GPⅡb的第26外顯子上存在I843S和V837M 2個(gè)多態(tài)性，分別構(gòu)成HPA-3和HPA-9血型。GPⅢa的第3、4、10、12外顯子上存在L33P、R143Q、R489Q、P407A、R636C、R62Q、R663H 多態(tài)性，構(gòu)成 HPA-1、HPA-4、HPA-6、HPA-7、HPA-8、HPA-10和HPA-11共7個(gè)血型。

本研究通過(guò)對(duì)98例長(zhǎng)期輸注PLT的血液病患者GPⅡb和GPⅢa的9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GPⅡb上存在I 843S多態(tài)性，即HPA-3aa、HPA-3ab和HPA-3bb 3個(gè)基因型，其余多態(tài)性未檢出。迄今為止，已有多篇文獻(xiàn)［1-7］報(bào)道了不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同人群的HPA基因檢測(cè)頻率存在差異。我國(guó)漢族人群的HPA多態(tài)性大多集中在HPA-1～6和 HPA-15上，特別是 HPA-3和HPA-15，該二者的a、b等位基因頻率幾乎各占一半，其a/b抗原不配合幾率越高，在PLT輸注時(shí)刺激受者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生PLT抗體的幾率就越大，HPA-3尤為嚴(yán)重。本研究結(jié)果顯示，98例患者HPA-3的基因頻率趨勢(shì)與報(bào)道類(lèi)似，因是收治的血液病患者而非普通人群調(diào)查，所以只能顯示大體趨勢(shì)。本研究未檢出多態(tài)性的HPA-4、7、8、9、10、11的aa型頻率在江蘇、浙江、上海地區(qū)漢族人群中均為100%［6］，HPA-1、6的 aa型頻率均＞98%。本研究的標(biāo)本量相對(duì)較小，是未能檢出多態(tài)性的原因。

GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，改變了其抗原性，調(diào)節(jié)了其表達(dá)水平，表面抗原構(gòu)象的改變導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而影響PLT輸注的療效，出現(xiàn)輸注耐受現(xiàn)象。PLT抗體包括特異性抗體和相關(guān)性抗體，分別由HPA、共同抗原(包括 HLA和ABO、Lewis、P等紅細(xì)胞血型抗原)免疫刺激而產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，98例患者長(zhǎng)期輸注PLT后，有52%的患者產(chǎn)生PLT抗體，有效輸注率為77.8%。產(chǎn)生PLT抗體的患者并非每次輸注隨機(jī)的PLT都無(wú)效，本研究結(jié)果顯示，HPA-3ab型患者輸注有效率最高(78.9%)，aa 型 居 中 (77.2%)，bb 型 最 低(76.3%)。這種情況可能與獻(xiàn)血員的PLT血型有關(guān)。如aa型患者數(shù)量多于bb型，根據(jù)基因頻率，此型獻(xiàn)血員數(shù)量也應(yīng)該多于bb型，而ab型患者可接受aa、bb和ab 3種基因型的PLT，這些因素可能是造成aa型和ab型患者PLT輸注有效率略高的原因。此外，PLT相關(guān)抗體中的HLA抗體對(duì)PLT輸注效果影響很大，故HPA-3ab型患者并非每次輸注都有效，而且21例有抗體的患者輸注65袋配合型的PLT后，療效僅為83.1%。HPA抗體最易產(chǎn)生，但由于HLA更具多態(tài)性，因此HLA抗體更常見(jiàn)。機(jī)體產(chǎn)生的HLA抗體往往具有多特異性。當(dāng)HLA抗體合并HPA抗體時(shí)，PLT輸注無(wú)效更易發(fā)生。HLA抗體數(shù)量占主要地位，其次為HPA抗體［8-9］。故PLT抗體是造成輸注無(wú)效的免疫性原因，PLT GP多態(tài)性是產(chǎn)生PLT抗體的主要原因之一。

全世界每年用于治療性輸注的PLT有幾百萬(wàn)單位，但隨之而來(lái)的是由此而引發(fā)的同種免疫應(yīng)答等造成的輸注無(wú)效［10］。治療PLT輸注無(wú)效，應(yīng)當(dāng)從病因著手，采取不同的治療方案。由非免疫因素引起的輸注無(wú)效，應(yīng)以治療原發(fā)病為主，如抗感染、脾切除、增加PLT輸注量來(lái)提高效果，而由免疫因素引起的，則應(yīng)首先選擇PLT相容性輸注［11］，即選擇 ABO同型、HLA和 HPA交叉配型均相合的單采PLT輸注［12］，給患者輸注“合適的PLT”，取代隨機(jī)性 PLT的輸注［13］。但在實(shí)際工作中尋找三者完全相同的PLT非常困難，只有部分患者可在其親屬中找到，因此除依靠采血機(jī)構(gòu)建立HLA和HPA供者分型庫(kù)提供及時(shí)、有效的輸注途徑外，臨床上使用去除白細(xì)胞的PLT、γ-輻照PLT、藥物(丙種球蛋白)等也是必不可少的治療方案。

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