張立濤 李素彥 許 寧 趙鶴齡(河北省人民醫(yī)院急診科，河北 石家莊 05005)

膿毒癥早期就已存在心肌器質(zhì)性損傷，且發(fā)生率很高，其機(jī)制復(fù)雜，其中一氧化氮(NO)在膿毒癥心肌損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。核因子(NF)-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度活化與人類(lèi)疾病的發(fā)生關(guān)系密切。膿毒癥時(shí)NF-κB活性的增高調(diào)控iNOS的在心肌細(xì)胞中表達(dá)增加，可能是心肌損傷發(fā)生的機(jī)制之一。他汀類(lèi)藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑是一種廣泛應(yīng)用的降脂藥物，并可以減少患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，他汀類(lèi)藥物尚有與降低血脂無(wú)關(guān)的多種生物作用，這種多效性包括:抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝血、穩(wěn)定血管內(nèi)皮等，膿毒癥患者的功能異常往往就表現(xiàn)在以上幾個(gè)方面，因此理論上他汀類(lèi)藥物可以改善膿毒癥患者的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)，觀察膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與NF-κB的表達(dá)，并評(píng)價(jià)辛伐他汀對(duì)二者表達(dá)的影響及意義，進(jìn)一步探討辛伐他汀的心臟保護(hù)性作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 30只雌性Wistar大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250～270 g。采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)〔1〕建立膿毒癥模型。麻醉前禁食8 h，以10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。常規(guī)消毒腹部皮膚，于腹部皮膚正中做切口，長(zhǎng)約2 cm，打開(kāi)腹腔后小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。盲腸如有糞便，則輕輕將其擠向與其相連的大腸，在盲腸與小腸及大腸交界處，用4-0號(hào)絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸，避免結(jié)扎回腸和盲腸系膜血管。結(jié)扎完畢后仔細(xì)檢查，保持腸道通路暢通。在與腸系膜相對(duì)的盲端腸壁漿膜面用18號(hào)針頭穿刺三次，擠出適量腸內(nèi)容物，并留置一寬約0.2 cm，長(zhǎng)約3 cm橡皮引流條貫通盲腸，以防針孔閉合，輕輕將腸管放回原處，逐層縫合，關(guān)閉腹腔。

1.2 動(dòng)物分組及處理 雌性Wistar大鼠30只，正常喂養(yǎng)，經(jīng)1 w適應(yīng)期后利用隨機(jī)數(shù)字表分為正常組(N組)10只，造模組(CLP組)10只，辛伐他汀組(S組)10只。S組開(kāi)始喂養(yǎng)辛伐他汀20 mg/kg(舒降之，默沙東，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H19990366)，用生理鹽水配成等濃度藥液灌胃(5 mg/ml)，每天1次，持續(xù)2 w。正常組和造模組用生理鹽水灌胃(4 ml/kg)，每天1次，持續(xù)2 w。2 w后造模組及辛伐他汀組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，各組于術(shù)后48 h分別取大鼠左心室心肌組織，置入10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.3 試驗(yàn)方法 iNOS一抗為兔抗大鼠IgG多克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶200。NF-κB p65一抗為小鼠抗大鼠IgG單克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶80。DAB顯色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.1 標(biāo)本HE染色 石蠟切片二甲苯脫蠟至水→蘇木素染色5 min，流水沖洗數(shù)次→1%鹽酸酒精分化20 s，1/400氨水返藍(lán)，間以流水沖洗1 min→伊紅染色5 min，流水沖洗30 s→梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片→光鏡下讀片。

1.3.2 S-P三步法免疫組織化學(xué)法染色 石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min→蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min→盛有枸櫞酸鹽酸緩沖液的高壓鍋中進(jìn)行高壓抗原熱修復(fù)10 min→3%H2O2室溫孵育 5～10 min，PBS沖洗，2 min×3次→5% ～10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗，37℃ 孵育2 h→PBS沖洗，2 min×3次→滴加1%BSAPBS稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃ 孵育10～30 min→PBS沖洗，2 min×3次→滴加PBS稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素，37℃ 孵育15 min→PBS沖洗，2 min×3次→DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。

1.3.3 染色結(jié)果的判定 iNOS陽(yáng)性染色為在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉著。NF-κB p65陽(yáng)性染色為在細(xì)胞質(zhì)(部分在細(xì)胞核)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉著。陽(yáng)性細(xì)胞必須具備:①細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰;②陽(yáng)性顆粒定位、定性好;③著色明顯高于背景。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):參照Soslow〔2〕的評(píng)分方法，應(yīng)用美國(guó)多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)分析:每張切片隨機(jī)取5個(gè)(×200)高倍視野，采用陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比雙重判定進(jìn)行評(píng)分，并將二者評(píng)分乘積作為最終評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。等級(jí)資料采用多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)及兩獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況 CLP組大鼠術(shù)后表現(xiàn)出無(wú)活力，反應(yīng)差，發(fā)紺，立毛和呼吸急促的特點(diǎn)。打開(kāi)腹腔后可見(jiàn)血性腹水，可聞及惡臭味，并發(fā)現(xiàn)部分大鼠腸管水腫，盲腸發(fā)黑，可見(jiàn)膿苔。相比之下，S組大鼠表現(xiàn)相對(duì)較輕。

2.2 HE染色結(jié)果 N組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)正常。CLP組大鼠心肌纖維水腫，疏松，間質(zhì)充血水腫，部分可見(jiàn)淀粉樣變性。心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞部分腫脹，局部脫落，缺損。而S組心肌的組織病理學(xué)改變相比CLP組較輕，見(jiàn)圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.3.1 iNOS的表達(dá) N組大鼠心肌細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)微量。CLP組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多棕黃色或棕色顆粒沉著，與N組相比明顯增加(P＜0.05)。S組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒與CLP組相比明顯減少并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與N組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

2.3.2 NF-κB的表達(dá) N組大鼠心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)微量。CLP組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色或黃色顆粒沉著，部分細(xì)胞核黃染，與N組相比明顯增加(P＜0.05)。S組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒與CLP組相比明顯減少并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與 N組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖3，表2。

表1 各組大鼠心肌組織iNOS(n，n=10)

表2 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(dá)(n，n=10)

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)點(diǎn)(HE，×200)

圖2 各組心肌組織iNOS表達(dá)(DAB，×200)

圖3 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(dá)(DAB，×200)

3 討論

3.1 膿毒癥模型的建立 建立標(biāo)準(zhǔn)化的膿毒癥動(dòng)物模型是探索膿毒癥病理生理學(xué)機(jī)制和防治措施的重要環(huán)節(jié)，在膿毒癥研究領(lǐng)域具有舉足輕重的作用。膿毒癥動(dòng)物模型目前常用的有內(nèi)毒素誘導(dǎo)、細(xì)菌注射、腹膜炎模型即盲腸結(jié)扎穿孔模型等方法。用CLP方法造模，炎癥部位是否被大網(wǎng)膜包裹關(guān)系到膿毒癥動(dòng)物模型的成功與否，并與實(shí)驗(yàn)者手術(shù)方法(如穿孔大小、盲腸結(jié)扎程度)和動(dòng)物的種系、年齡、性別有關(guān)，人為控制存在一定困難，但是該模型操作起來(lái)相對(duì)簡(jiǎn)便，通過(guò)外科手術(shù)而引起腹腔感染，與臨床上化膿性闌尾炎穿孔形成的腹膜炎相似。本實(shí)驗(yàn)采用CLP法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，使有菌的腸內(nèi)容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發(fā)廣泛的全身性炎性反應(yīng)。根據(jù)術(shù)后大鼠的表現(xiàn)及處死后解剖所見(jiàn)，符合膿毒癥動(dòng)物模型的基本要求〔3〕，因此，利用此模型進(jìn)行研究更具說(shuō)服力，更貼近臨床。

3.2 膿毒癥時(shí)心功能異常的特征與機(jī)制 Waisbren等〔4〕最早在臨床發(fā)現(xiàn)由于膿毒癥所導(dǎo)致的心臟功能異常的現(xiàn)象，雖然膿毒癥患者心輸出量大致正常，但是每搏量和射血分?jǐn)?shù)明顯降低〔5〕，一旦膿毒癥患者出現(xiàn)心臟功能異常，其死亡率會(huì)明顯增加。Natanson等〔6〕對(duì)犬膿毒癥模型的研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)其心臟的收縮與舒張功能都受到明顯抑制。目前，大量臨床〔7，8〕與基礎(chǔ)〔9〕研究證明，心肌收縮力的降低與順應(yīng)性的下降是膿毒癥時(shí)心臟功能異常的主要原因。雖然右心室與左心室在結(jié)構(gòu)及功能上有一定的差異，但在膿毒癥過(guò)程中其功能障礙與左心室表現(xiàn)基本相似〔10〕。雖然關(guān)于膿毒癥時(shí)心臟功能異常機(jī)制的研究取得巨大進(jìn)展，但其確切機(jī)制至今仍不明確，這其中涉及多種因素，包括:心肌抑制物、細(xì)胞因子、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)和前列腺素類(lèi)物質(zhì)的作用等，其中大量研究發(fā)現(xiàn)高水平的NO可以抑制心肌收縮功能。

NO在心血管系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。其可以在不同的生理和病理生理?xiàng)l件下調(diào)整心臟的功能。許多實(shí)驗(yàn)表明高劑量的NO對(duì)心肌收縮功能具有抑制作用。Brady等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)給豚鼠腹腔注射內(nèi)毒素，4 h后取出心臟，測(cè)定心室肌細(xì)胞的收縮性，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞收縮力明顯下降。這種作用可被一氧化氮合酶(NOS)抑制劑N-硝基-L精氨酸甲酯(L-NAME)所逆轉(zhuǎn)，提示內(nèi)毒素激活NOS可產(chǎn)生NO，而抑制心肌收縮力。另外作者〔12〕給正常的豚鼠離體心室肌細(xì)胞直接應(yīng)用NO及NO供體硝普鈉，也出現(xiàn)了心肌細(xì)胞收縮功能的減退，直接證明了NO對(duì)心肌收縮功能的抑制作用，并認(rèn)為這與NO影響心肌細(xì)胞環(huán)鳥(niǎo)苷酸的產(chǎn)生有關(guān)。Kelm等〔13〕則證實(shí)高劑量的NO對(duì)心肌收縮力的影響與其抑制心肌細(xì)胞能量產(chǎn)生有關(guān)。

NO是在NOS催化左旋精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮习彼岬倪^(guò)程中合成的。NOS有三個(gè)亞型，包括神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。iNOS在體內(nèi)分布較廣，已證實(shí)心肌組織中許多成分如心肌細(xì)胞、心臟微血管的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞都有分布。Wagner等〔14〕發(fā)現(xiàn) iNOS可以在細(xì)胞因子如 IL-1β、TNFα、IFNγ、IL-6 等的刺激下經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)NF-κB系統(tǒng)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控合成，并產(chǎn)生大量NO。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用免疫組化的方法對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn):造模后48 h，心肌細(xì)胞的NF-κB和iNOS的蛋白表達(dá)明顯增加，因此認(rèn)為與CLP后炎癥因子激活NF-κB系統(tǒng)使iNOS表達(dá)增加有關(guān)，并因此造成模型大鼠心肌細(xì)胞受損。

3.3 他汀類(lèi)藥物抗膿毒癥作用 他汀類(lèi)藥物抗膿毒癥作用機(jī)制較為復(fù)雜，同時(shí)也是多方面的，包括抗炎、抗凝血、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等效應(yīng)。Merx等〔15〕采用CLP法復(fù)制小鼠膿毒癥模型，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)他汀類(lèi)藥物預(yù)處理的小鼠平均存活率是對(duì)照組的4倍。Chaudhry等〔16〕發(fā)現(xiàn)西立伐他汀可以明顯降低由脂多糖所誘導(dǎo)的小鼠促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，加快細(xì)菌清除，提高小鼠的生存率。他汀類(lèi)藥物同時(shí)可以改善膿毒癥時(shí)腎臟〔17〕和心臟功能〔18〕。

Huang等〔19〕在對(duì)LPS和IFN-γ刺激后的小鼠巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀可以抑制巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)，并認(rèn)為這與他汀類(lèi)藥物可以抑制NF-κB活性和STAT-1磷酸化有關(guān)。Wagner等〔14〕對(duì)細(xì)胞因子刺激后的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以減弱內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB和STAT-1的核轉(zhuǎn)運(yùn)，使iNOS的表達(dá)減少。Madonna等〔20〕對(duì)經(jīng)TNF-α和IL-1刺激后的大鼠心臟胚胎細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以提高NF-κB的抑制物IκB水平，并減少其細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量，因此減少iNOS mRNA及iNOS蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)辛伐他汀預(yù)處理的大鼠在造模后48 h，心肌細(xì)胞的NF-κB和iNOS的蛋白表達(dá)較造模組明顯減少，考慮與辛伐他汀抑制NF-κB的活性，進(jìn)而降低iNOS在心肌細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)，因此理論上20 mg/kg辛伐他汀可以減少膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞NO的產(chǎn)生，起到心肌保護(hù)性作用。

本研究主要通過(guò)免疫組化的方法研究辛伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠的心肌保護(hù)性作用，受研究方法與樣本數(shù)所限，結(jié)果存在一定局限性。同時(shí)20 mg/kg的辛伐他汀的劑量只是參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行的探索性實(shí)驗(yàn)，因此其他劑量與種類(lèi)的他汀類(lèi)藥物的實(shí)驗(yàn)效果有待進(jìn)一步研究。

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