李立宏 蔣麗娜 石永威 張曉麗 孫 黎 羅 強(qiáng) 賈天軍 (河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

吳茱萸堿是傳統(tǒng)中藥吳茱萸的主要生物堿之一。近來發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可抑制人乳腺癌細(xì)胞〔1〕、前列腺腫瘤細(xì)胞〔2〕、小鼠肝癌細(xì)胞〔3〕、人胃癌細(xì)胞〔4〕、人白血病細(xì)胞〔5〕等的腫瘤細(xì)胞株，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，能抑制腫瘤血管生成及浸潤轉(zhuǎn)移。有關(guān)吳茱萸堿在動物整體抗腫瘤方面的研究很少見到。本實(shí)驗(yàn)觀察了吳茱萸堿對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用，以及對血細(xì)胞的影響，為吳茱萸堿的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)動物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行整體研究，進(jìn)一步探討吳茱萸堿體內(nèi)的抑瘤作用及其抑瘤機(jī)制，這既是全面、客觀評價(jià)吳茱萸堿抗腫瘤作用的需要，也是將來應(yīng)用于臨床之前所必需提供的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 吳茱萸堿均購自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司(批號：ZL081012GC)。注射用環(huán)磷酰胺(200 mg/支，批號：06112020)，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供，本院實(shí)驗(yàn)中心凍存。昆明小鼠，體重18～22 g，清潔級，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物室。BC-2000血液分析儀(深圳邁瑞公司)及配套試劑。

1.2 小鼠S180肉瘤移植瘤模型建立 小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細(xì)胞株接種于小鼠腹腔，7 d后，脫頸椎處死，置于75%的乙醇浸泡5 min消毒，無菌抽取腹水瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.3×107/ml，于昆明種小鼠左后肢行無菌皮下接種0.2 ml細(xì)胞懸液，于30 min內(nèi)接種完成。接種后第6天全部出現(xiàn)瘤塊，小鼠移植瘤模型全部成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 接種后將小鼠按體重隨機(jī)分為3組：模型組(0.5%羧甲基纖維素鈉，劑量10 ml/kg)、陽性對照組(給予環(huán)磷酰胺，劑量50 mg/kg)、吳茱萸堿組(給予吳茱萸堿，劑量50 mg/kg)。每組小鼠10只，雌雄各半。接種后第6天，腫瘤模型組和吳茱萸堿組每日灌胃一次，連續(xù)12次，陽性對照組隔日給藥一次，腹腔注射，連續(xù)6次。于停藥當(dāng)日從尾部采集血液，于2 h內(nèi)測試完畢。停藥后次日處死。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 每日觀察各組實(shí)驗(yàn)動物的生長情況。停藥后次日，處死全部動物，剝?nèi)×鰤K，稱重，按公式計(jì)算抑瘤率。各組瘤體組織標(biāo)本常規(guī)固定，脫水，透明，包埋，切片，HE染色觀察。于停藥當(dāng)日從尾部采集血液20 μl，預(yù)稀釋后于2 h內(nèi)測試完畢。按照儀器說明書操作，使用配套試劑，測試前先做室內(nèi)質(zhì)控，保證儀器質(zhì)控狀態(tài)良好。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物生長情況 結(jié)果顯示，昆明小鼠接種S180后，模型組小鼠進(jìn)食量明顯減少，精神狀態(tài)較差，行動欠靈活，皮毛發(fā)澀。而吳茱萸堿給藥組的小鼠，其進(jìn)食量及運(yùn)動狀態(tài)均好于模型組，皮毛順滑;在吳茱萸堿組，有1只小鼠的腫物出現(xiàn)明顯的破皮結(jié)痂現(xiàn)象。

2.2 吳茱萸堿對小鼠S180肉瘤腫瘤模型生長的抑制作用。見表1。吳茱萸堿對腫瘤抑制率43.6%，且抑制率與模型對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，說明吳茱萸堿在體內(nèi)有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

表1 吳茱萸堿對小鼠S180肉瘤腫瘤模型生長的抑制作用(n=10)

2.3 小鼠S180肉瘤組織病理學(xué)變化 HE染色，顯微鏡觀察。腫瘤模型組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，腫瘤細(xì)胞大小不一，胞核有明顯異型性，可見瘤組織呈巢狀或片狀生長，壞死不明顯，片狀壞死區(qū)面積較小，可見癌巢間微血管較豐富，周圍有程度不等的炎性細(xì)胞浸潤。環(huán)磷酰胺組有大片的腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)，甚至80%～90%的區(qū)域壞死，瘤組織呈片狀或團(tuán)狀生長。吳茱萸堿組均可見不同程度的片狀壞死區(qū)域，瘤組織內(nèi)的微血管減少，周圍有程度不等的炎性細(xì)胞浸潤。

2.4 吳茱萸堿對S180肉瘤荷瘤小鼠外周血血常規(guī)的影響見表2。吳茱萸堿(劑量50 mg/kg)能升高S180荷瘤小鼠外周血的白細(xì)胞(P＜0.05)，對其他血細(xì)胞(紅細(xì)胞和血小板)的影響不大。

表2 吳茱萸堿對S180肉瘤荷瘤小鼠外周血血常規(guī)的影響( s ，n=10)

表2 吳茱萸堿對S180肉瘤荷瘤小鼠外周血血常規(guī)的影響( s ，n=10)

與模型組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 白細(xì)胞(×109/L)血小板(×109/L)紅細(xì)胞(×1012/L)血紅蛋白(g/L)±23.10陽性對照組 7.40±2.252)1 071.75±315.94 6.90±1.44 125.20±21.44吳茱萸堿組19.45±4.751)模型組 15.19±4.51 1 315.00±120.91 7.67±1.53 130.50 1 077.70±175.14 8.80±1.69 152.60±29.00

3 討論

目前，臨床使用的抗腫瘤藥物大多存在毒副作用強(qiáng)、對機(jī)體損害大的不良反應(yīng)，尋求安全有效、低毒的抗腫瘤藥物一直受到國內(nèi)外醫(yī)藥界專家學(xué)者的高度重視。最近發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，但這些報(bào)導(dǎo)多為體外抗腫瘤作用研究，有關(guān)其在動物整體抗腫瘤方面的研究少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)顯示吳茱萸堿作用于S180荷瘤小鼠的抑瘤率為43.6%，抑制作用較強(qiáng)，但不及環(huán)磷酰胺的抑瘤作用，吳茱萸堿作為抗腫瘤藥有較大的開發(fā)潛力。宋穎等〔6〕也研究了吳茱萸堿對小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌腹水型HepA的影響，小鼠左腋部皮下分別接種S180和HepA，灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，結(jié)果顯示吳茱萸堿對S180和 HepA的生長均具有明顯的抑制作用，20、10和5 mg/kg吳茱萸堿，可使抑瘤率達(dá)到30% ～60%左右。

眾所周知，環(huán)磷酰胺在臨床應(yīng)用中的副作用明顯，主要表現(xiàn)為骨髓抑制，導(dǎo)致白細(xì)胞和血小板減少以及貧血。本文也觀察到陽性對照組的白細(xì)胞數(shù)量明顯低于腫瘤模型組，而吳茱萸堿對S180荷瘤小鼠外周血的白細(xì)胞數(shù)不但無降低作用，而且有升高作用。提示吳茱萸堿抗腫瘤作用機(jī)制之一可能是通過增加荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞的數(shù)量，從而抑制腫瘤的生長，達(dá)到抗腫瘤的目的。宋朝陽等〔7〕將8周齡雄性C57BL/6小鼠處死，取胸腺、脾組織研磨過濾為單細(xì)胞懸液，MTT顯示當(dāng)濃度≥0.5 μmol/L時，吳茱萸堿在24、48和72 h均明顯抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖;吳茱萸堿處理的小鼠脾和胸腺細(xì)胞釋放IL-2、IL-12的功能較對照組明顯減低。因此，需進(jìn)一步研究吳茱萸堿對荷瘤小鼠免疫能力的影響，以及吳茱萸堿與環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用，能否對抗環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞數(shù)下降，從而達(dá)到減毒增效作用。

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3 譚宇蕙，吳映雅，鐘富有，等.吳茱萸堿對小鼠肝癌細(xì)胞生長的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用〔J〕.中國藥理與臨床，2006;22(3-4)：33-5.

4 譚宇蕙，陳蔚文，吳映雅，等.小檗堿、吳茱萸堿和靛玉紅對人胃癌細(xì)胞的作用比較〔J〕.世界華人消化雜志，2005;13(4)：472-6.

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6 宋 穎，趙文杰，宋 宇，等.吳茱萸堿體內(nèi)抗腫瘤作用研究〔J〕.吉林中醫(yī)藥，2008;28(12)：934-6.

7 宋朝陽，鄧 蘭，胡海燕，等.吳茱萸堿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用〔J〕. 中藥材，2008;31(6)：885-8.