李作生 王國臣 陳志全 鄭貿(mào)根 侯靜樸 (河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院胸心外科，河北 唐山 063000)

LKB1即絲氨酸-蘇氨酸激酶11(STK11)，是Peutz-Jeghers綜合征(PJS)的致病基因。有研究認(rèn)為，LKB1基因突變?cè)诜伟┲蟹浅Ｆ毡椤?，2〕，LKB1在肺癌發(fā)生、發(fā)展、分化和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用〔3〕。但目前對(duì)LKB1蛋白表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性研究少見報(bào)道。本文應(yīng)用免疫組化方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌病人的癌組織及正常肺組織的LKB1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究，分析LKB1的蛋白表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2007～2010年河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌76例(腺癌、鱗癌各38例，高分化腫瘤33例，中-低分化腫瘤43例)。其中男性54例，女性22例;年齡56～78歲，平均年齡66歲。所有病例術(shù)前未行放化療。

1.2 取材處理 所有癌組織均取自癌腫原發(fā)灶，避開壞死、炎癥區(qū)域;正常組織取自距癌腫邊緣5 cm以上的正常肺組織(經(jīng)病理檢查證實(shí)無轉(zhuǎn)移)。

1.3 免疫組化染色及主要試劑 采用免疫組化非生物素即用型二步法。非生物素即用型二步法染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)用一抗為鼠抗人LKB1單克隆抗體ab15095，為美國Abcam公司產(chǎn)品。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)抗鼠-兔聚合物，與即用型免疫組化 EliVision plus試劑盒(鼠-兔)均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.4 結(jié)果判定 采取雙盲法閱片，由兩位病理學(xué)專家觀察病理切片。判斷細(xì)胞染色的強(qiáng)度時(shí)要求這些著色顆粒清晰可見并定位準(zhǔn)確，而且背景清晰。染色深淺需與背景著色相對(duì)比。每張切片至少觀察4個(gè)視野，對(duì)所測(cè)部位進(jìn)行準(zhǔn)確定位后，由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像，再用電腦進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。LKB1蛋白位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)，顯示為棕黃色顆粒。陽性標(biāo)準(zhǔn)(按陽性細(xì)胞所占百分比)：≥25%為表達(dá)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。LKB1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LKB1在肺癌組織及正常肺組織中的表達(dá) LKB1蛋白在肺癌組織及癌旁正常肺組織中均有表達(dá)，其陽性染色呈棕黃色顆粒彌漫性分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。圖1顯示LKB1呈棕黃色顆粒。LKB1在肺癌組織中表達(dá)的陽性率為65.79%，在正常肺組織的陽性表達(dá)率為90.78%，兩者比較差異有顯著性意義(χ2=13.973，P=0.000)。

2.2 LKB1在肺腺癌和鱗癌中的表達(dá) LKB1蛋白在肺鱗癌組織中的表達(dá)陽性率為66.16%，在肺腺癌組織中的表達(dá)陽性率為68.42%;兩者比較無顯著差異(χ2=0.234，P=0.629)。

2.3 LKB1表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系 LKB1蛋白在高分化腫瘤中的表達(dá)陽性率(81.82%)明顯高于中-低分化腫瘤(53.49%)(χ2=6.658，P=0.010)。

2.4 LKB1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 LKB1蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的陽性表達(dá)率為52.08%，而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率(89.29%)明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組(χ2=10.875，P=0.001)。

圖1 肺癌及癌旁組織LKB1蛋白表達(dá)(DAB，×200)

3 討論

LKB1基因位于人染色體19p，其功能主要是使細(xì)胞周期阻滯在G1期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)胚胎血管形成等。LBK1蛋白具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，通過磷酸化底物蛋白或與靶蛋白結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)〔4，5〕。LKB1幾乎在人的所有組織中均有表達(dá)。LKB1基因的突變見于各種病理類型的肺癌〔1～3，6，7〕。2002 年 Sanchez-Cespedes實(shí)驗(yàn)室首先報(bào)道了在肺腺癌中存在相當(dāng)比例的LKB1功能性缺失突變〔8〕。之后 Matsumoto等〔7〕通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌中腺癌的大規(guī)模測(cè)序分析亦得出類似結(jié)論。Koivunen等〔9〕通過對(duì)北美以及東亞原發(fā)性肺癌標(biāo)本的研究得出北美人群相對(duì)于東亞人群存在較多的LKB1突變率，以及腺癌多于鱗癌的特點(diǎn)。這些研究提示LKB1的體細(xì)胞突變?cè)诜伟┌l(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。LKB1基因的改變常和其他重要的腫瘤基因突變包括KRAS和TP53并存，尤其是LKB1基因改變經(jīng)常與另外一個(gè)位于染色體19p的腫瘤抑制基因BRG1失活同時(shí)發(fā)生〔10，11〕，說明肺癌的發(fā)生是多種腫瘤基因共同作用的結(jié)果。

本研究結(jié)果說明在腺癌和鱗癌中均存在LKB1基因異常導(dǎo)致的LKB1蛋白表達(dá)的異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LKB1蛋白隨著腫瘤分化程度的降低其表達(dá)陽性率也下降，可能提示LKB1蛋白的低表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)腫瘤的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性程度升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出LKB1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，LKB1蛋白低表達(dá)者容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明LKB1蛋白表達(dá)下調(diào)也可能減弱了其對(duì)肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制能力。這些研究結(jié)果說明LKB1具有抑癌作用，其機(jī)制可能與其對(duì) VEGF 的調(diào)控有關(guān)〔12，13〕，LKB1 能夠下調(diào) VEGF 的表達(dá)，從而抑制腫瘤新生血管產(chǎn)生，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

1 Osoegawa A，Kometani T，Nosaki K，et al.LKB1 mutations frequently detected in mucinous bronchioloalveolar carcinoma〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2011;41(9)：1132-7.

2 Gill RK，Yang SH，Meerzaman D，et al.Frequent homozygous deletion of the LKB1/STK11 gene in non-small cell lung cancer〔J〕.Oncogene，2011;30(35)：3784-91.

3 Ji HB，Ramsey MR，Hayes DN，et al.LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis〔J〕.Nature，2007;448(7155)：807-10.

4 Karuman P，Gozani O，Odze RD，et al.The Peutz Jegher gene product LKB1 is a mediator of p53 dependent cell death〔J〕.Mol Cell，2001;7(6)：1307-19.

5 Tiainen M，Ylikorkala A，Makela TP.Growth suppression by Lkb1 is mediated by a G(1)cell cycle arrest〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(16)：9248-51.

6 Amin RM，Hiroshima K，Iyoda A，et al.LKB1 protein expression in neuroendocrine tumors of the lung〔J〕.Pathology International，2008;58(2)：84-8.

7 Matsumoto S，Iwakawa R，Takahashi K，et al.Prevalence and specificity of LKB1 genetic alterations in lung cancers〔J〕.Oncogene，2007;26(40)：5911-8.

8 Sanchez-Cespedes M，Parrella P，Esteller M，et al.Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung〔J〕.Cancer Res，2002;62(13)：3659-62.

9 Koivunen JP，Kim J，Lee J，et al.Mutations in the LKB1 tumour suppressor are frequently detected in tumours from Caucasian but not Asian lung cancer patients〔J〕.Br J Cancer，2008;99(2)：245-52.

10 Sanchez-Cespedes M.The role of LKB1 in lung cancer〔J〕.Fam Cancer，2011;10(3)：447-53.

11 Rodriguez-Nieto S，Sanchez-Cespedes M.BRG1 and LKB1：tales of two tumor suppressor genes on chromosome 19p and lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2009;30(4)：547-54.

12 Safe S，Abdelrahim M.Sp transcription factor family and its role in cancer〔J〕.Eur J Cancer，2005;41(16)：2438-48.

13 臧遠(yuǎn)勝，夏天保，李 強(qiáng).抑癌基因LKB1對(duì)肺癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)調(diào)控〔J〕.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007;28(6)：624-8.