章海風(fēng) 陳 敏 路新國(guó) 陸紅梅 (揚(yáng)州大學(xué)營(yíng)養(yǎng)系，江蘇 揚(yáng)州 225001)

γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，約50%的中樞突觸部位是以GABA作為中樞傳導(dǎo)遞質(zhì)，通過(guò)其特異性受體介導(dǎo)，在控制神經(jīng)元興奮性方面發(fā)揮著重要作用，Diao等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)在貓的初級(jí)視皮層內(nèi)Glu-IR和GABA-IR的含量顯著下降，認(rèn)為其可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)性視功能衰退的重要因素。徐業(yè)華等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠與青年大鼠相比，視皮層GABA含量明顯下降。谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA的合成酶，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)可催化GABA與α-酮戊二酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，生成琥珀酸半醛和谷氨酸，是GABA的代謝酶。根據(jù)前期的中醫(yī)方劑文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，枸杞子和菊花是中醫(yī)眼科方劑中高頻用藥〔2〕，具有明目、抗氧化、抗衰老等功效。我們采用自然衰老大鼠模型，通過(guò)鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生反向高效液相色譜法對(duì)大鼠視皮層GABA含量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定GAD、GABA-T的活性，以期明確GABA的增齡性變化及杞菊提取液對(duì)其改善調(diào)節(jié)功效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 56只清潔級(jí)SD大鼠〔許可證號(hào)為SCXK(蘇)2008-0004〕，其中3～4月齡大鼠16只，雌雄各半，為青年對(duì)照組;20～22月齡老年大鼠40只，雌雄各半。裂隙燈顯微鏡下排除眼疾個(gè)體。

1.2 藥物 枸杞菊花水提液制備:寧夏枸杞、汞菊按1∶1稱重，除雜后60℃干燥箱中干燥3 h，冷卻后，中藥粉碎機(jī)粉碎。固液比1∶10，80℃水浴浸提3 h，過(guò)濾，濾液再加5倍蒸餾水同法浸提2 h，合并濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最后用蒸餾水調(diào)至0.4 g/ml。按人與大鼠用藥比〔3〕設(shè)置0.5 g/kg(3.5倍)、1.0 g/kg(7倍)、2.0 g/kg(14倍)(生藥/大鼠體重)等低中高三個(gè)劑量組。4℃保存。明目地黃丸樣品液制備:明目地黃丸粉碎后按人用藥量7倍加入雙蒸水，80℃水浴溶解2 h，作為陽(yáng)性對(duì)照組。4℃保存。

1.3 儀器與試劑 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGF30/7-IA)，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;優(yōu)普超純水系統(tǒng);數(shù)顯恒溫水浴箱(HH-8)，國(guó)華電器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52B)，上海亞榮生化儀器廠;超速高速冷凍離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特公司;低速離心機(jī);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Spectrumlab 755s)，上海棱光技術(shù)有限公司;PH計(jì)(PHS-3C)，上海精科儀器有限公司;裂隙燈顯微鏡(M339801)，北京中西遠(yuǎn)大有限公司。寧夏枸杞、貢菊、明目地黃丸購(gòu)自國(guó)藥控股江蘇有限公司，丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)及蛋白定量(雙縮脲法)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 分組與處理 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后采用隨機(jī)分組法分成7組，每組8只，雌雄各半:A組:青年藥物組(中劑量提取液)，B組:青年陰性對(duì)照組(生理鹽水)，C組:老年陰性對(duì)照組(生理鹽水)，D1組:干預(yù)低劑量組(低劑量提取液)，D2組:干預(yù)中劑量組(中劑量提取液)，D3組:干預(yù)高劑量組(高劑量提取液)，E組:陽(yáng)性對(duì)照組(明目地黃丸)。飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件:環(huán)境溫度22～27℃，相對(duì)濕度50% ～70%，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。每組動(dòng)物喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料。采用灌胃給藥。給藥劑量1 ml/100 g(體重)，每天上午給藥1次，大鼠喂養(yǎng)5 w后稱重，拉頸椎處死，立即摘取左眼球，取下視皮質(zhì)(紋狀皮質(zhì)17區(qū)、18區(qū)、18a區(qū))，分別稱重，左腦加入9倍預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，離心(3 000 r/min×20 min)，取上清液用于測(cè)定視皮質(zhì)蛋白及GABA含量。右腦視皮層加入10倍冰冷的勻漿緩沖液(甘油 200 ml/L，TritonX-100 1.3 g/L，GSH 10－4mol/L，PLP 10－4mol/L，Na2EDTA 10－3mol/L，K2HPO4/KH2PO410－2，pH6.8)，勻 漿 后，離 心20 min，收集上清液用于GAD、GABA-T活性的檢測(cè)。

1.5 大鼠視皮質(zhì)中GABA含量、GAD與GABA-T活性檢測(cè)大鼠視皮質(zhì)中GABA含量測(cè)定:OPA柱前衍生反向高效液相色譜法。色譜分析條件:流動(dòng)相為0.05 mol/L醋酸鈉:四氫呋喃:甲醇(50∶1∶49)調(diào)pH至4.3。該 流動(dòng)相通過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，真空脫氣后使用。柱溫(25±2)℃。流速為1 ml/min。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng) 337 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為454 nm。進(jìn)樣量20 μl。標(biāo)準(zhǔn)品配制:將 GABA標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水配制成0.009 375、0.018 75、0.031 25、0.075、0.15 μg/ml。衍生化試劑配制:OPA用色譜甲醇溶解，濃度為5 mg/ml，避光冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。處理分析:取樣品液(用前稀釋50倍)或標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μl，依次加入 OPA 衍生液 100 μl、硼酸鹽緩沖液(pH 9.9)375 μl、MPA 25 μl，旋渦混勻器混勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣，從加OPA到進(jìn)樣控制在2 min內(nèi)。

大鼠視皮質(zhì)GAD活性檢測(cè):比色法。200 μl底物溶液(10 mmol/L L-MSG 和0.1 mmol/L PLP)和 100 μl樣品液在30℃反應(yīng)20 h，然后置于冰浴中，加入 200 μl硼酸緩沖液(pH9.0)終止反應(yīng)，再加入1.0 ml 6%苯酚和400 μl次氯酸鈉(含活性氯5.25%)溶液，充分振蕩后，在沸水浴中反應(yīng)10 min，迅速在冰浴中冷卻20 min，在630 nm測(cè)定吸光值，相對(duì)酶活力以單位時(shí)間內(nèi)每毫克蛋白A630值的變化表示，每組測(cè)定同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，求平均值。

大鼠視皮質(zhì)GABA-T活性檢測(cè):微量紫外比色法。取樣品勻漿上清30 μl加入到570 μl、pH8.75的磷酸緩沖液中(NAD+10－3mol/L，α-巰基乙醇 3.5 ×10－3mol/L)搖勻后再加入 20 μl底物溶液(α-酮戊二酸 4.8 mmol/L，GABA18 mmol/L)，30℃保溫15min，340nm比色測(cè)定生成物NADH濃度，GABA-T的活性以每min每mg蛋白樣品催化生成NADH的nmol數(shù)表示(nmol·min－1·mgprot－1)。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以s表示;兩樣本比較采用成組t檢驗(yàn);多組間比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)方差齊后，用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 30 d飼養(yǎng)后，各組進(jìn)食量和體重均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但從外表觀察，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠皮毛較為稀疏，無(wú)光澤，個(gè)別大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，可能是年齡較大的個(gè)體差異。

2.2 杞菊提取液對(duì)大鼠視皮層GABA含量的影響 青年組GABA含量明顯高于老年組，青年藥物組明顯高于空白組(P＜0.01);老年中劑量組、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組GABA含量明顯高于老年空白組，差異性顯著(P＜0.01)，但低劑量組與空白組無(wú)顯著差異，低中高三個(gè)劑量組之間差異性顯著(P＜0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組的GABA含量接近中劑量組，高劑量組高于陽(yáng)性對(duì)照組含量(P＜0.05)。說(shuō)明枸杞菊花有提高大鼠視皮質(zhì)中GABA含量的作用，且高劑量組效果最優(yōu)。見(jiàn)表1。

2.3 杞菊提取液對(duì)大鼠視皮質(zhì)GABA-T的影響 青年組GABA-T值顯著低于老年組(P＜0.01)，青年藥物組顯著低于青年空白組(P＜0.01);老年低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組顯著低于老年空白組(P＜0.01)，老年低劑量組顯著高于中高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.01)，老年中高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組之間則無(wú)顯著差異(P＞0.05)。說(shuō)明老年大鼠視皮質(zhì)中的GABA-T活力較青年大鼠高，枸杞菊花有降低大鼠視皮質(zhì)中GABA-T活力的作用。且高劑量組效果最優(yōu)。見(jiàn)表1。

2.4 杞菊提取液對(duì)大鼠視皮質(zhì)GAD的影響 青年空白組(0.007 080±0.000 13)顯著高于其他6組(P＜0.01);與老年空白組(0.005 775±0.000 09)比較，低、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組 GAD活力上升(0.006 220±0.000 14，0.006 005±0.000 16，0.006 177±0.000 44，P＜0.01)，高劑量組(0.005 993±0.000 19)稍高于空白組，但無(wú)顯著差異，低劑量組顯著高于高劑量組(P＜0.01)。青年大鼠的視皮質(zhì)GAD值高于老年大鼠，枸杞菊花對(duì)老年大鼠視皮質(zhì)GAD值有不同程度的提高，其中以低劑量組效果最優(yōu)。

表1 各組大鼠視皮層中GABA的含量、GABA-T活性及GAD活性比較(n=8，s)

表1 各組大鼠視皮層中GABA的含量、GABA-T活性及GAD活性比較(n=8，s)

與B組比較:1)P＜0.01，與C組比較:2)P＜0.01，D1、D2、D3組間比較:3)P＜0.01，與D3組比較:4)P＜0.01

GABA(μg/g)108.54±1.66 91.08±3.35 61.74±6.43 65.95±3.111)2)3)75.30±3.412)3) 85.27±4.972)3) 76.79±4.524)GABA-T(nmol·min－1·mgprot－1)26.93±3.161) 36.21±2.75 66.44±2.251) 60.92±2.942)4) 51.96±2.632) 50.22±4.862) 52.77±4.442)

3 討論

隨著衰老，人及動(dòng)物的視覺(jué)功能出現(xiàn)進(jìn)行性衰退，表現(xiàn)為視銳度，減小、對(duì)視覺(jué)刺激的對(duì)比敏感度和波長(zhǎng)的敏感性下降、對(duì)視覺(jué)刺激方位和運(yùn)動(dòng)方向的辨別能力下降以及對(duì)視覺(jué)信息的分析速度和計(jì)算效率降低。然而老年性視覺(jué)能力降低并非完全可以用眼的光學(xué)因素和視網(wǎng)膜老年性變化來(lái)解釋，由衰老引起的神經(jīng)中樞的結(jié)構(gòu)與生理功能變化可能在其中也起著重要作用。Schmolesky等〔3〕發(fā)現(xiàn)皮層內(nèi)GABA能系統(tǒng)抑制作用的減弱可能導(dǎo)致了老年性視覺(jué)方向與方位選擇性的降低。Katzner等〔4〕通過(guò)對(duì)貓局部的電離子透入療法后，記錄視皮層中選擇性GABA拮抗劑，發(fā)現(xiàn)視皮層中GABA抑制劑能有效幫助提高對(duì)視覺(jué)刺激的選擇性，通過(guò)調(diào)節(jié)他們獲得的反應(yīng)來(lái)控制視皮層神經(jīng)細(xì)胞的敏感性。Leventhal等〔5〕發(fā)現(xiàn)，施加 GABA及GABAA受體激動(dòng)劑可使老年猴視皮層細(xì)胞較大地恢復(fù)對(duì)視覺(jué)刺激的方位和運(yùn)動(dòng)方向選擇性，而對(duì)青年猴的作用要小得多。老年性GABA能系統(tǒng)退化可能不僅與其特異性受體表達(dá)量的減少有關(guān)，遞質(zhì)含量的降低也應(yīng)該具有重要影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示視覺(jué)皮層內(nèi)GABA抑制作用的減弱可能是引起視覺(jué)功能衰退的重要原因之一。

GAD和GABA-T分別是GABA的合成與分解酶，它們含量與活性的高低對(duì)于體內(nèi)GABA水平具有重要意義。衰老可能導(dǎo)致GAD的mRNA與蛋白表達(dá)量降低，活性下降，而GABA-T的表達(dá)量與活性都出現(xiàn)年齡相關(guān)性增加，這表明GABA的增齡性變化是由GAD與GABA-T協(xié)調(diào)控制的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，與青年大鼠相比，老年大鼠空白組視皮層中有GAD活性下降，GABA-T活性上升的現(xiàn)象，這可能是視皮層中GABA表達(dá)量隨年齡降低的直接原因。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)枸杞子和菊花提取液能夠降低GABA分解酶GABA-T的活性，提高合成酶GAD的活性，并具有一定的量效關(guān)系，從而推斷杞菊提取液可能對(duì)老年性視功能的衰退具有一定的改善作用。

同時(shí)，隨著年齡的增長(zhǎng)，人體視功能會(huì)出現(xiàn)年齡相關(guān)性的衰退，除了藥物等相關(guān)治療，及早預(yù)防具有更大的意義。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，杞菊提取液對(duì)青年大鼠視皮層中的GABA-T和GAD的活性也具有同樣的影響。中醫(yī)認(rèn)為枸杞子味甘，性平，歸入肝、腎經(jīng)。能滋補(bǔ)肝腎，益精明目，為腎虛內(nèi)障之良藥?！侗静萁?jīng)疏》:“枸杞子，潤(rùn)而滋補(bǔ)，兼能退熱，而專于補(bǔ)腎、潤(rùn)肺、生津、益氣，為肝腎真陰不足、勞乏內(nèi)熱補(bǔ)益之要藥。老人陰虛者十之八九，故服食家為益精明目之上品?！本栈ㄎ陡士?，性微寒，歸入肺、肝經(jīng)。以疏風(fēng)散熱、平肝明目著稱，為眼科常用藥。兩者都屬于衛(wèi)生部公布的既是食品又是藥品的范疇，因此，枸杞子和菊花可以作用一種保健食品長(zhǎng)期的使用，對(duì)預(yù)防老年性視功能的衰退具有一定的功效。

綜上所述，杞菊提取液可提高大鼠視皮層GABA含量和GAD活性，降低GABA-T活性，從而改善或延緩老年視功能的衰退，并有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

1 Diao JG，Xu JW，Li GZ，et al.Age-related changes of Glu/GABA expression in the primary visual cortex of cat〔J〕.Zool Res，2009;30(1):38-44.

2 徐業(yè)華，陳 勤，李燕斐，等.老年大鼠視皮層γ-氨基丁酸的代謝變化〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007;27(13):1232-4.

3 Schmolesky MT，Wang YC，Pu ML，et al.Degradation of stimulus selectivity of visual cortical cells in senescenthresus monkeys〔J〕.Nat Neurosci，2000;3(4):384-90.

4 Katzner S，Busse L，Carandini M.GABA(A)inhibition controls response gain in visual cortex〔J〕.J Neuroscience，2011;31(16):5931-41.

5 Leventhal AG，Wang Y，Pu M，et al.GABA and its agonists improved visual cortical function in senescent monkeys〔J〕.Science，2003;300(5620):812-5.