姚興軍 王岳華 侯文仲 鄧光策 曾敏敏 關(guān)北漩 (清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 清遠(yuǎn) 511518)

蜂毒肽(Melittin)又稱蜂毒溶血肽，是蜂毒(Bee venom)的主要活性成分，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗輻射等作用〔1〕。近年來有關(guān)蜂毒肽抗癌作用的報(bào)道增多，引起了廣泛的關(guān)注〔2，3〕。但是天然蜂毒肽來源有限，成本極高，使其應(yīng)用受到影響〔1〕，因此逐漸傾向于用人工重組的蜂毒肽代替天然提取的蜂毒肽使用。本實(shí)驗(yàn)研究重組蜂毒肽(Recombinant melittin)對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44的抑制作用，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞庫;重組蜂毒肽由本實(shí)驗(yàn)室合成制備;胰蛋白酶、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，其他試劑及試劑盒均由美國(guó)Sigma公司提供。

1.2 SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 將SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 MMT法檢測(cè)重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞，0.25%胰酶消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整至 1×106/ml，然后接種于 96孔板中(每孔100 μl)，放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的重組蜂毒肽(20、40、80 mg/L)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于重組蜂毒肽加入后24、48、72 h后棄去上清液，各孔分別加入20 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心棄去培養(yǎng)液，每孔中分別加入150 μl DMSO，震蕩10 min后，置于酶標(biāo)儀中于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)，不加細(xì)胞的空白溶液調(diào)零。對(duì)照組除不加入重組蜂毒肽外，其他與實(shí)驗(yàn)組同法操作。同時(shí)，分別計(jì)算不同濃度的重組蜂毒肽作用24、48、72 h后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，抑制率 =(1－A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.4 Western印跡法測(cè)定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(STAT3)、VEGF蛋白的表達(dá)〔4〕取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，然后接種于96孔板中(每孔100 μl)，放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的重組蜂毒肽(20、40、80 mg/L)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加入重組蜂毒肽的對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，停止培養(yǎng)，用PBS洗板2次，加入細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解20 min，于4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行抗體標(biāo)記、成像顯影、漂洗(以β-actin蛋白為內(nèi)參)，采用圖像分析軟件測(cè)定記錄各條帶的吸光度(A)，以不加入細(xì)胞的空白溶液調(diào)零。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用s表示，采用單因素方差進(jìn)行處理，組間比較采用SNK檢測(cè)法。

2 結(jié)果

2.1 重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用 MMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:重組蜂毒肽20、40、80 mg/L作用于SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞48、72 h后，對(duì)細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，其中以40、80 mg/L兩個(gè)劑量組抑制作用尤為顯著(P＜0.01)，并且抑制率呈劑量依賴性。見表1。

表1 重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用( s，n=5)

表1 重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用( s，n=5)

與對(duì)照組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 24 h吸收度(A)抑制率(%)48 h吸收度(A)抑制率(%)72 h吸收度(A)抑制率(%)對(duì)照組46.51±0.64 0.84±0.14 － 1.49±0.14 － 0.86±0.15 －低劑量組 0.82±0.12 2.38±0.22 1.39±0.051) 6.71±0.15 0.71±0.171) 15.48±0.36中劑量組 0.82±0.17 2.38±0.19 1.24±0.172) 16.79±0.33 0.58±0.162) 32.56±0.55高劑量組 0.81±0.15 3.57±0.25 1.03±0.092) 30.87±0.24 0.46±0.122)

表2 不同濃度重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3、VEGF蛋白表達(dá)的影響( s，n=6)

表2 不同濃度重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3、VEGF蛋白表達(dá)的影響( s，n=6)

與對(duì)照組組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01

0.57±0.21 0.67±0.15低劑量組 0.54 0.18 0.59±0.16中劑量組 0.48±0.131) 0.46±0.211)高劑量組 0.37±0.192) 0.33±0.142)蛋白對(duì)照組組別 STAT3蛋白 VEGF

圖1 不同濃度重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3、VEGF蛋白表達(dá)的影響

2.2 重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3、VEGF蛋白表達(dá)的影響 Western印跡結(jié)果表明，不同濃度重組蜂毒肽作用于SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞 72 h后，低、中、高劑量組(20、40、80 mg/L)細(xì)胞STAT3及VEGF表達(dá)均呈遞減趨勢(shì)，并具有劑量依賴性，其中低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組均有顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。見圖1，表2。

3 討論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤為常見的顱內(nèi)腫瘤疾病，發(fā)病來源于神經(jīng)上皮細(xì)胞，約占顱內(nèi)腫瘤疾病的40% ～50%，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高及治愈率低的特點(diǎn)〔5，6〕。目前臨床常見的治療方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療等，其中手術(shù)治療在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中具有重要意義，但由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞邊界不十分清晰，其手術(shù)療效受醫(yī)生臨床水平及醫(yī)療條件等諸多因素的影響;放、化療副作用較大，且應(yīng)用受具體病情等條件的局限，目前僅作為配合術(shù)后加強(qiáng)治療或復(fù)發(fā)治療使用〔7，8〕。因此，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療藥物及治療機(jī)制的研究顯得尤為重要。

研究表明〔9〕，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，STAT3高表達(dá)，STAT3可能是一種癌基因，它參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常可能在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。此外，據(jù)有關(guān)研究報(bào)道〔10〕，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于正常的神經(jīng)上皮組織，且神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度與腫瘤組織中VEGF的含量相關(guān)性極高，因此神經(jīng)膠質(zhì)瘤與VEGF蛋白的表達(dá)具有極大的相關(guān)性。最新文獻(xiàn)報(bào)道，STAT3能直接調(diào)控 VEGF的轉(zhuǎn)錄〔11〕，持續(xù)激活STAT3能誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤新生血管形成;阻斷STAT3的激活能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及微血管的形成〔12〕，提示STAT3、VEGF的協(xié)同表達(dá)很可能是膠質(zhì)瘤的重要發(fā)病因素之一。本研究提示重組蜂毒肽可能是通過影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3和VEGF蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究初步探討了重組蜂毒肽對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)研究了其對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3、VEGF蛋白表達(dá)的影響，為重組蜂毒肽治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤疾病藥物的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。

1 王關(guān)林，邢 卓.蜂毒肽的研究及展望〔J〕.遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005;28(1):87-91.

2 高啟龍，李玉梅，陳永強(qiáng)，等.蜂毒素對(duì)骨肉瘤UMR-106細(xì)胞裸鼠移植瘤血管生成的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008;26(3):522-4.

3 李愛劍，梁 楓.蜂毒素對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)中醫(yī)急癥，2009;18(50):780-1.

4 肖麗君，趙恩宏，趙 爽，等.17-AAG對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)STAT3和VEGF表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013;42(1):65-8.

5 趙理樂.腦膠質(zhì)瘤的臨床治療前景展望〔J〕.中國(guó)腫瘤臨床，2008;35(2):113-6.

6 王俊杰，王 剛，周章明，等.神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的治療研究進(jìn)展〔J〕.癌癥進(jìn)展，2011;9(1):63-7.

7 柳秀芳，夏云飛，柳 青，等.164例膠質(zhì)瘤術(shù)后放射治療療效及預(yù)后〔J〕.中華放射腫瘤學(xué)雜志，2001;10(2):108-11.

8 陳忠平，周旺寧.我國(guó)膠質(zhì)瘤診斷治療現(xiàn)狀和努力方向〔J〕.中國(guó)腫瘤，2005;14(2):78-81.

9 Kunigal S，Lakka SS，Sodadasu PK，et al.Star3-siRNA induces Fasmediated apoptosis in vitro and in vivo in breast cancer〔J〕.Int J Oncol，2009;34(5):1209-20.

10 陳金緒，李建安，陳月新.巢蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011;27(6):685-8.

11 Cascio S，F(xiàn)erla RD，Andrea A，et al.Expressionofangiogenic regulators，VEGF and leptin，is regulated by the EGF/PI3 K/STAT3 pathway in colorectal cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2009;221(1):189-94.

12 Page BD，Ball DP，Gunning PT.Signal transducer and activator of transcription 3 inhibitors:a patent review〔J〕.Expert Opin Ther Pat，2011;21(1):65-83.