許官學(xué) 石 蓓 盛 瑾 郭小英 楊文筆 雷艷娟

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

動(dòng)物模型是研究人類急性心肌梗死(AMI)的重要工具〔1〕。研究中結(jié)扎冠狀動(dòng)脈是制作AMI動(dòng)物模型的常用方法。其中SD大鼠因來源方便、價(jià)格便宜、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，常被選用制作AMI模型。然而，在AMI模型建立中肺損傷、冠狀動(dòng)脈左前降支定位錯(cuò)誤、麻醉和呼吸機(jī)應(yīng)用不當(dāng)?shù)仍颍稍斐蒘D大鼠死亡率過高甚至制模失敗。本研究針對(duì)如何成功建立大鼠AMI模型并降低其死亡率方法進(jìn)行評(píng)估分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性SD大鼠，體重200～250 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠AMI模型的建立 42只SD大鼠稱重，戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。將麻醉、備皮后的大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)用木板上，常規(guī)消毒鋪巾，頸部正中切開皮膚，甲狀腺下方1～2個(gè)氣管環(huán)狀軟骨切開氣管，插管，連接呼吸機(jī)(潮氣量3 ml/100 g;呼吸頻率100次/min;呼吸比1∶3)。胸骨左緣心臟搏動(dòng)明顯處縱行切開皮膚約3 cm，經(jīng)左第3、4肋間進(jìn)入胸腔。結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。利多卡因1～2滴滴于心臟表面預(yù)防心律失常。2/0縫線關(guān)閉胸腔。動(dòng)物蘇醒后拔除氣管插管，8/0無損傷縫合針閉合氣管。2/0縫線縫合頸部皮膚。皮下注射2～3 ml無菌生理鹽水。大鼠先放入清潔鼠籠，站燈加熱。溫度維持在35℃ ～37℃〔3〕。大鼠完全清醒后轉(zhuǎn)至普通鼠籠中，置于27℃空調(diào)房?jī)?nèi)正常飼養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)注射青霉素鈉3 d(40 萬 U/d)，防止切口感染〔3〕。

1.2.2 AMI模型的鑒定

1.2.2.1 心電圖 心電圖針形電極在麻醉生效后插入大鼠四肢皮下。觀察術(shù)前和術(shù)后各導(dǎo)聯(lián)ST段改變情況。AMI模型成功標(biāo)志為心電圖肢導(dǎo)R波振幅明顯升高，Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)0.5 h以上。

1.2.2.2 超聲心動(dòng)圖檢查 大鼠AMI后4 w，再次腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，用Philips多功能超聲診斷儀在胸骨旁觀察心室壁厚度改變情況。

1.2.2.3 形態(tài)觀察 術(shù)后2只大鼠在未關(guān)胸時(shí)，沿胸腹部交界，切開皮膚至兩側(cè)前后肢連線處，于胸廓下緣切開肌肉進(jìn)入腹腔，前正中線處切開肌肉向下沿長(zhǎng)切口達(dá)膀胱水平，將肌肉向兩側(cè)牽拉，暴露腹腔。切開膈肌，注意不要損傷肺組織及前正中線旁胸廓內(nèi)動(dòng)脈，眼科剪沿前后肢連線剪開皮膚及胸廓，達(dá)近前肢處。向前上方抬起胸廓前壁同時(shí)，分離心臟與胸廓前壁粘連，完全暴露跳動(dòng)心臟及大血管。腹腔內(nèi)腸管向右方推移，可見腹后壁前方左腎及左腎動(dòng)靜脈，用5 ml注射器于左腎靜脈內(nèi)緩慢注入約3 ml亞甲藍(lán)，觀察心肌血運(yùn)情況。

術(shù)后4 w，頸椎脫臼法處死大鼠，從大鼠劍突下剪開一個(gè)弧形切口，切口兩端延伸至大鼠腋下，小心剪開膈肌后即可看到跳動(dòng)的心臟〔4〕，用無菌紗布輕輕將心臟從周圍粘連組織中剝離，離斷主動(dòng)脈根部，迅速取出心臟。用生理鹽水及磷酸鹽緩沖液(PBS)各沖洗3遍，沖洗干凈心臟內(nèi)積血。觀察心臟的外形變化，與相同月齡及大小的大鼠心臟比較。

1.2.2.4 組織病理學(xué)鑒定 術(shù)后4w取出心臟，沖洗凈心臟內(nèi)積血后去除心房、大血管及心臟外結(jié)締組織等。10%甲醛固定，送病理切片作蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活率 SD大鼠40只，術(shù)中死于大出血1支，死于心室顫動(dòng)和惡性心律失常1只，存活率為95%。繼續(xù)觀察飼養(yǎng)4 w，1只死于不明原因，4 w時(shí)存活率為92.5%。

2.2 肉眼觀 SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后數(shù)分鐘可見結(jié)扎線以下左室前壁及心尖部心肌組織由紅色變?yōu)榘导t或紫紅色，并伴隨心肌運(yùn)動(dòng)減弱或消失。此時(shí)經(jīng)大鼠左腎靜脈注入亞甲藍(lán)可見正常血供心肌藍(lán)染，而梗死區(qū)域心肌組織無藍(lán)染現(xiàn)象。術(shù)后4 w，結(jié)扎線以下左室前壁心肌呈典型室壁瘤表現(xiàn)，左室壁變薄，呈半透明狀，局部隨心臟搏動(dòng)呈反常搏動(dòng)。

2.3 超聲心動(dòng)圖檢查 正常組SD大鼠心臟超聲心動(dòng)圖可見左室心肌厚度均勻，舒縮運(yùn)動(dòng)正常。AMI后4 w時(shí)超聲心動(dòng)圖下見梗死區(qū)域心室壁呈室壁瘤樣改變，室壁厚度菲薄，局部向外擴(kuò)張，并隨心室舒縮活動(dòng)呈明顯反常搏動(dòng)。見圖1。

2.4 心肌組織HE染色 術(shù)后4 w時(shí)，光鏡下見結(jié)扎線以上非心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞較正常對(duì)照組代償性肥大，細(xì)胞橫紋及閏盤清晰，纖維結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而梗死區(qū)域心肌細(xì)胞因缺血出現(xiàn)壞死，壞死心肌表現(xiàn)為纖維化、結(jié)構(gòu)排列紊亂。心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)界限明顯，在交界處組織中可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

2.5 心肌組織Masson染色 左心室梗死區(qū)膠原纖維顯著增多，呈條索狀，部分膠原纖維融合。梗死區(qū)與非梗死區(qū)邊界清晰，可見毛細(xì)血管增生。見圖3。

圖1 AMI 4 w后心臟長(zhǎng)軸超聲心動(dòng)圖心室前壁改變

圖2 各組心肌組織HE染色

圖3 正常心肌masson染色

3 討論

AMI動(dòng)物模型的建立方法目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道眾多，方法已經(jīng)基本成熟，但手術(shù)成功率及老鼠死亡率等不盡相同。倪新海等〔5〕建立的Wistar大鼠AMI模型600只，術(shù)后24 h存活率70%，術(shù)后8 w存活率62%。劉元生等〔6〕報(bào)道AMI 3 w以上大鼠存活率為78.1%:Sia等〔8〕及高琴等〔9〕報(bào)道 AMI大鼠術(shù)后24 h成活率分別為49%和52.5%。本研究AMI大鼠存活率較上述報(bào)道明顯提高。

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 目前國(guó)內(nèi)外常用的AMI模型的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、兔、小型豬、犬等。相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，大鼠有以下優(yōu)勢(shì):種群純正，個(gè)體變異性小，價(jià)格低廉，基因與人類相似度高，可復(fù)制出多種人類疾病模型。在心血管疾病研究方面，因?yàn)榇笫蟮墓跔顒?dòng)脈系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定、變異性低、側(cè)支循環(huán)少，是冠脈疾病模型制備及研究的良好動(dòng)物模型來源〔9～11〕。為了能夠建立穩(wěn)定、可靠及重復(fù)性好的AMI模型，大鼠的選擇盡量保持種族、體重、性別、月齡的一致性，達(dá)到AMI模型標(biāo)準(zhǔn)化。

3.2 麻醉方法的選擇 對(duì)大鼠的麻醉方法常見的有腹腔注射、靜脈注射、吸入麻醉三種方法，試驗(yàn)中用于麻醉藥物有戊巴比妥、水合氯醛、氯胺酮、烏拉坦、阿托品、利多卡因等。其中戊巴比妥鈉溶液或水合氯醛通過腹腔注射給藥可以達(dá)到理想的麻醉效果〔11〕，優(yōu)點(diǎn)為給藥途徑便利、麻醉起效快、麻醉深度適中。但在具體應(yīng)用中應(yīng)當(dāng)警惕麻藥劑量的選擇，應(yīng)當(dāng)按體重計(jì)算，從低劑量開始給藥，如10%水合氯醛按照300 mg/kg為起始量，5～10 min起效，若此時(shí)麻藥仍未起效，可按50 mg/kg逐量追加給藥。反之，大鼠容易發(fā)生麻醉過深，導(dǎo)致術(shù)后大鼠復(fù)蘇時(shí)間延長(zhǎng)，脫離呼吸機(jī)困難，此外還可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺水腫、感染、酸堿失衡、呼吸肌麻痹、氣道分泌物過多而窒息，增加了大鼠圍術(shù)期死亡率。

3.3 氣道建立的方法 有少量報(bào)道在制備AMI模型過程中不予氣管插管〔14〕，在很短的時(shí)間迅速開胸并行冠脈結(jié)扎術(shù)。此方法在實(shí)際應(yīng)用中有大量不易克服的技術(shù)弊端:技術(shù)含量高、操作難度大、圍術(shù)期存活率低。現(xiàn)在AMI模型制備中多用小動(dòng)物呼吸機(jī)維持呼吸，相對(duì)不受時(shí)間限制，術(shù)者可仔細(xì)操作，從而使AMI成功率及圍術(shù)期死亡率明顯下降?，F(xiàn)在較常用的大鼠氣管插管方法有經(jīng)口氣管插管和氣管切開插管。經(jīng)口氣管插管最符合生理狀態(tài)，且對(duì)動(dòng)物機(jī)體損傷小，但技巧難度較大，對(duì)術(shù)者要求高，需要長(zhǎng)時(shí)間訓(xùn)練，在操作中若反復(fù)插管刺激，會(huì)導(dǎo)致氣道分泌物增加，氣道阻塞、窒息，并可出現(xiàn)喉頭損傷、誤插入食管等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致大鼠死亡〔15〕。本實(shí)驗(yàn)選用氣管切開法，能在術(shù)中直視操作，短時(shí)間訓(xùn)練及可熟練操作。需要注意的是，該方法術(shù)后可能發(fā)生氣道分泌物過多及少量積血堵塞氣道，致窒息死亡。因此術(shù)中應(yīng)避免損傷血管神經(jīng)和腺體，及時(shí)清理術(shù)區(qū)積血，術(shù)后用50 ml注射器接16G靜脈留置針通過抽吸吸出氣管內(nèi)痰液及血液，暢通呼吸道，提高存活率。

氣管插管呼吸機(jī)輔助呼吸開始后，從開胸結(jié)扎左前降支冠脈到關(guān)胸過程中有可能因未及時(shí)發(fā)現(xiàn)氣管插管脫落、堵塞致動(dòng)物死亡。因此術(shù)中需注意:①麻醉后大鼠肢體、頭部及氣管插管后均要穩(wěn)妥固定，防止術(shù)中人為原因引起動(dòng)物滑動(dòng);牢固固定手術(shù)臺(tái)板，避免因動(dòng)物或手術(shù)臺(tái)板活動(dòng)造成氣管插管拽脫;②氣管切開過程中需仔細(xì)操作，避免唾液腺體及氣管旁血管損傷，防止血液及分泌物流入氣管管腔內(nèi)阻塞氣管及氣管插管;③保持氣管插管通暢，避免因插管彎折致堵塞。

3.4 開胸方法的改良 本文結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道作了部分改良:手術(shù)切口定位在胸骨左緣心臟搏動(dòng)處，縱行切開皮膚長(zhǎng)約3 cm，鈍性分離皮下結(jié)締組織和肌肉(胸大肌斜行，胸小肌呈縱行)，不要切斷胸大小肌。充分暴露第3、4肋間后，眼科剪平行肋骨方向分離肋間肌，直至進(jìn)胸，術(shù)中注意避免過分靠近中線及側(cè)方，以防損傷胸骨旁胸廓內(nèi)動(dòng)脈及肺組織。進(jìn)胸后換閉合小止血鉗，鈍性分離肋間肌，切斷第5肋。眼科鑷沿心臟頂部或底部小心提起心包并撕開心包膜，注意不要損傷左側(cè)心包中走行的左側(cè)膈神經(jīng)及伴行血管。通過方法改良，能在術(shù)中充分暴露心臟及大血管，并減少出血。因未切斷胸大、小肌，術(shù)后關(guān)胸時(shí)，胸大小肌能從不同方向原位覆蓋肋間切口，并與皮膚切口方向互相交錯(cuò)，有效防止術(shù)后切口漏形成氣胸。

3.5 冠脈結(jié)扎部位 AMI結(jié)扎部位的選擇是整個(gè)模型的重點(diǎn)也是難點(diǎn)，尤其是左冠狀動(dòng)脈前降支的定位及結(jié)扎是本模型的關(guān)鍵。開胸后能夠充分暴露心臟前壁及大血管是下一步結(jié)扎冠脈的基礎(chǔ)。綜合文獻(xiàn)報(bào)道及自身實(shí)踐操作，進(jìn)針標(biāo)志為左冠狀動(dòng)脈主干左心耳下方2 mm，肺動(dòng)脈圓錐旁出針，此時(shí)不要急于結(jié)扎，可暫時(shí)輕用力提起縫線兩端，保持張力，在此過程中動(dòng)態(tài)觀察心電圖變化，必須見到ST段弓背向上持續(xù)抬高及心肌表面顏色發(fā)白，左室收縮活動(dòng)減弱，初步判斷冠脈前降支確切在縫線內(nèi)后再進(jìn)行打結(jié)結(jié)扎。如沒有以上表現(xiàn)，或因局部刺激后血管短暫痙攣心肌變蒼白，但很快恢復(fù)正常，則表明未能成功將左前降支冠脈縫扎，立即抽出縫線，重新仔細(xì)辨認(rèn)解剖標(biāo)志后再次進(jìn)針。結(jié)扎的深度約0.5 mm、寬度約2～3 mm，過多會(huì)導(dǎo)致大面積心肌因機(jī)械變性發(fā)生梗死面積過大，可導(dǎo)致術(shù)后心功能過差，甚至引起大鼠死亡，反之不易一次結(jié)扎成功，也可造成縫線撕脫引起大出血。本組動(dòng)物有一只即因此原因出現(xiàn)大出血致死。在結(jié)扎過程中及結(jié)扎成功后可能會(huì)有AMI后心律失常出現(xiàn)，且大多是惡性室性心律失常，如室早二聯(lián)律、心室顫動(dòng)，用注射器將少量利多卡因滴入心臟表面可防治惡性室性心律失常。針對(duì)術(shù)后可能出現(xiàn)的心動(dòng)過緩，在心臟表面滴注阿托品，可提高心率，同時(shí)減少氣管內(nèi)分泌物，建議常規(guī)備用。

3.6 脫機(jī) 不管是人類還是動(dòng)物，術(shù)后停用呼吸機(jī)輔助呼吸，恢復(fù)自主呼吸都是手術(shù)的難點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中需針對(duì)不同動(dòng)物個(gè)體做到個(gè)體化處理。不同個(gè)體老鼠對(duì)麻醉藥物反應(yīng)不一，因此術(shù)中麻醉深度不盡相同，術(shù)后需呼吸機(jī)輔助呼吸時(shí)間變化較大。當(dāng)術(shù)后大鼠出現(xiàn)明顯自主呼吸并有肢體疼痛反射活動(dòng)后，可試停呼吸機(jī)，停機(jī)前注意先用止血鉗夾住呼吸機(jī)的出氣口管2～3個(gè)呼吸周期，待肺充分?jǐn)U張后將止血鉗松開，然后再夾住呼氣口管，觀察是否有胸廓起伏。若有自主呼吸可順利脫機(jī)。如脫機(jī)后出現(xiàn)呼吸緩慢，數(shù)分鐘無改善，須立即重新插管并聯(lián)接呼吸機(jī)，再次呼吸機(jī)輔助呼吸。

3.7 手術(shù)后措施 術(shù)后保暖，防止舌后墜，應(yīng)用抗生素，保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，保證飼料充足等措施可以有效預(yù)防術(shù)后感染、窒息、免疫力低下所致的死亡，所以不容忽視。

1 Utgens E，Daemen MJ，de Muinck ED，et al.Chronic myocardial infarction in the mouse:cardic structural and functional changes〔J〕.Cardiovasc Res，1999;41(3):586-93.

2 施新猷.醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1980:101.

3 孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:369.

4 Fox JG，Cohen BJ，Loew FM.Laboratory animal medicine〔M〕.New York:Academic Press，1984:31-2.

5 倪新海，郜朝暉，張宇清，等.提高心肌梗塞一心衰大鼠模型動(dòng)物存活率的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，1999;9(4):206-10.

6 劉元生，陳運(yùn)貞.慢性心肌梗塞大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀睯〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002;27(2):153-5.

7 Sia YT，Parker TG，Tsoporis JN.Long-term effects of carvedilol on left ventricular function，remodeling，and expression of cardiac cytokines after large myocardial infarction in the rat〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2002;39(1):73-87.

8 高 琴，關(guān)瑞錦.充血性心力衰竭大鼠模型的制作及意義〔J〕.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2004;13(1):27-30.

9 Kajstura J，Liu Y，Baldini A，et al.Coronary artery constriction in rats:Necrotic and apoptotic myocyte death〔J〕.Am J Cardiol，1998;82(5A):30-41.

10 華 平，熊利華，張 華，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植重建大鼠缺血心肌的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華顯微外科雜志，2004;27(2):117-9.

11 李亞輝，何建國(guó)，喬 木，等.直視下行大鼠氣管插管的改良方法〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2000;10(2):123-5.