廖 媛 齊曉嵐 官志忠 (成都市第六人民醫(yī)院病理科，四川 成都 60000)

阿爾茨海默病(AD)腦組織中典型神經(jīng)病理改變是老年斑(SP)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)形成及神經(jīng)元丟失等〔1〕。AD早期就有膽堿能缺失的癥狀，如果增加腦內(nèi)乙酰膽堿(Ach)遞質(zhì)水平，記憶功能就得以改善。有研究證明，Ach能影響炎性因子，迷走神經(jīng)的激活能抑制巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(TNF)，從而達(dá)到減少炎性反應(yīng)，這就是Ach抗炎機(jī)制的假說(shuō)〔2〕，稱(chēng)之為“膽堿能抗炎通路”(CAP)。Wang等〔3〕研究指出當(dāng)迷走神經(jīng)受到刺激后釋放的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)Ach與巨噬細(xì)胞α7尼古丁型乙酰膽堿受體(nAChR)受體結(jié)合后，抑制巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)的合成與分泌，削弱外周炎性反應(yīng)。nAChRs激活對(duì)炎性介質(zhì)表達(dá)的基因調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Aβ1～42購(gòu)自Sigma公司;兔抗 NF-κBp65多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;兔抗MCP-1單克隆抗體;兔抗MIP-1α單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司;兔抗TNF-α單克隆抗體購(gòu)自北京中杉公司;二抗購(gòu)買(mǎi)公司與一抗相同。ELISA試劑盒購(gòu)于上?；顦?lè)公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自Applied Biosystems公司。MTT購(gòu)自Sigma公司。

1.2 研究對(duì)象 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞培養(yǎng)及分組:選擇SH-SY5Y細(xì)胞株(德國(guó) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司)及本課題組保存的SH-SY5Y α3 nAChR siRNA細(xì)胞株;用含10%胎牛血清、雙抗(青霉素25 U/ml和鏈霉素25 U/ml)的DMEM作為培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育;待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，改用不含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用聚合后(37℃孵育3 d)的 Aβ1～42(1 μmol/L)處理培養(yǎng)細(xì)胞，然后分別培養(yǎng) 48 h;對(duì)照組不加Aβ處理。

1.3 MTT比色法 向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入一定數(shù)量(約1×104/孔)SH-SY5Y細(xì)胞，體積為150 μl/孔，培養(yǎng)使其貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，改用不含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分對(duì)照組(不加任何處理)和不同濃度 Aβ1～42處理組(0.01、0.1、1、2 及 5 μmol/L)，對(duì)照組和各濃度處理組均設(shè)復(fù)孔6個(gè)，處理細(xì)胞48 h(Aβ1～42預(yù)先用 DMSO稀釋?zhuān)?7℃孵育3 d后使用)，加入5 mg/ml MTT試劑，代謝4 h，小心吸棄上清液，加入細(xì)胞溶解液100 L/孔DMSO使細(xì)胞充分溶解。酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

1.4 Western印跡 用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞核蛋白。細(xì)胞核蛋白，BCA定量，－70℃凍存。Western印跡方法檢測(cè)各組細(xì)胞 NF-κBp65蛋白表達(dá)。以Bandscan軟件分析結(jié)果時(shí)以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算NF-κBp65蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)水平比。

1.5 ELISA 收集Aβ1～42處理各孔細(xì)胞培養(yǎng)基用ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi) MCP-1、MIP-1α、TNF-α表達(dá)情況。ELISA分析結(jié)果時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)曲線作為內(nèi)參照，計(jì)算 MCP-1、MIP-1α、TNF-α胞外分泌濃度(ng/L)作為蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)水平。

1.6 Trizol一步法提取各組細(xì)胞總RNA 取出處理好的細(xì)胞，在6孔板內(nèi)加1 ml Trizol，劇烈震蕩混勻，靜置5 min，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到DEPC水預(yù)處理的1.5 ml離心管，加氯仿 200 μl，輕搖 5 min，室溫靜置 2～3 min后，4℃12 000 r/min離心5 min，RNA樣品的純度、濃度和完整性鑒定，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞 NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、TNF-α mRNA 表達(dá)。實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果以cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，采用SybrGreen法測(cè)定。ABI step one plus型熒光定量PCR儀采集待測(cè)基因及內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)，以Applied Biosystems Step v 2.1軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。分析其△△Ct值及RQ值，RQ=2－△△Ct。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算 NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、TNF-α mRNA 和對(duì)照組的相對(duì)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用s表示，組間差異用t檢驗(yàn)方法。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列及PCR產(chǎn)物片段

2 結(jié)果

2.1 Aβ1～42處理 SH-SY5Y細(xì)胞存活率 0.1 mol/L濃度的Aβ1～42處理 SH-SY5Y細(xì)胞 48 h可見(jiàn) MTT還原率降低，表明Aβ1～42能明顯影響細(xì)胞增殖能力，具有一定的神經(jīng)毒性作用，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性負(fù)性相關(guān)關(guān)系。本研究選擇1 μmol/L濃度Aβ1～42處理細(xì)胞。0.01、0.1、1、2.5 μmol/L Aβ1～42處理 SHSY5Y細(xì)胞48 h MTT還原率分別為98.2%、89.8%、80.2%、58.7%、38.8%。

2.2 尼古丁受體基因siRNA后3尼古丁受體mRNA及蛋白表達(dá)水平 據(jù)前期實(shí)驗(yàn)表明，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western印跡方法檢測(cè)到SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒后mRNA及蛋白表達(dá)水平分別下98%及66%。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA不影響細(xì)胞α3尼古丁受體表達(dá)水平。

2.3 SH-SY5Y α3-nAChR siRNA 細(xì)胞株 NF-κBp65 核蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比較，Aβ1～42處理組、α3nAChR siRNA處理組SH-SY5Y細(xì)胞NF-κBp65核蛋白表達(dá)均增加(P＜0.05)。

2.4 SH-SY5Y α3nAChR siRNA 細(xì)胞株 MCP-1、MIP-1α、TNF-α蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比較，Aβ1～42處理組、α3nAChR siRNA處理組SH-SY5Y細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)分別增加31%(P＜0.05)和3%。MIP-1α蛋白表達(dá)分別增加102%和92%(P＜0.05)。TNF-α蛋白表達(dá)分別增加88%和97%(P＜0.05)。。

2.5 SH-SY5Y α3nAChR siRNA 細(xì)胞株 NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、TNF-α mRNA 表達(dá)情況 與對(duì)照組相比較，Aβ1～42處理組、α3nAChR siRNA處理組SH-SY5Y細(xì)胞NF-κBp65 mRNA表達(dá)分別增加25%和80%(P＜0.05)。MCP-1 mRNA表達(dá)分別增加41%(P＜0.05)和10%。MIP-1α mRNA表達(dá)分別增加102%和67%(P＜0.05)。TNF-α mRNA表達(dá)分別增加78%和131%(P＜0.05)。

3 討論

研究顯示，AD腦中最明顯和嚴(yán)重的改變?cè)谀憠A能系統(tǒng)，表現(xiàn)為海馬和大腦皮層膽堿能神經(jīng)元的缺失和功能異常，腦內(nèi)ACh濃度降低，腦脊液和腦組織中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯(AChE)活性降低，Ach合成、釋放、攝取功能下降，以及膽堿能受體數(shù)目減少等〔4〕。膽堿能受體最初根據(jù)其對(duì)天然生物堿毒蕈堿和尼古丁的藥理反應(yīng)性分為毒蕈堿型乙酰膽堿受體(mAChR)和尼古丁型乙酰膽堿受體(nAChR)。nAChRs在大腦的學(xué)習(xí)記憶、注意力的保持以及其他神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)功能等方面起著非常重要作用〔5〕，此外 nAChRs還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用〔6，7〕。

CAP通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子的合成反饋地監(jiān)控和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)〔8〕。運(yùn)用其反義寡核苷酸抑制α7亞單位以及基因敲除而缺失α7亞單位的研究中顯示出N型ACh受體α7亞單位是膽堿能抗炎通路的一個(gè)必需的組成部分。進(jìn)一步在α7尼古丁受體基因敲除的小鼠和野生對(duì)照小鼠相比較，用相同劑量的內(nèi)毒素誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥，α7尼古丁受體基因敲除的小鼠血清中和肝臟等組織中炎性介質(zhì)的水平顯著高于野生對(duì)照小鼠，而且電刺激野生型小鼠的迷走神經(jīng)能夠顯著降低其血清和組織中炎癥因子的水平，但在α7尼古丁基因敲除的小鼠，迷走神經(jīng)刺激對(duì)炎癥介質(zhì)的水平則沒(méi)有影響。Madden等〔9〕首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)腦單核巨噬細(xì)胞-小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上存在含有α7亞單位的N型受體，體外實(shí)驗(yàn)中ACh和煙堿預(yù)處理能抑制內(nèi)毒素引起的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF。這一作用可被亞單位拮抗劑所抑制。此研究結(jié)果提示中樞可能也存在與外周相似的膽堿能抗炎通路。Calogero等〔10〕報(bào)道在神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞，α7受體激動(dòng)劑經(jīng)Jak2(Jak2)和PI3K(PI3K)觸發(fā)蛋白激酶B(PKB)的磷酸化。研究證明，α7受體激動(dòng)劑主要通過(guò)兩條信號(hào)通路:Jak/STAT(Janus激酶信號(hào)/轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子)信號(hào)通路NF-κB信號(hào)通路。Bustin等〔11〕研究表明在不同細(xì)胞類(lèi)型包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，α7受體激動(dòng)劑的抗炎作用是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為nAChRs的抗炎作用提供了佐證。

1 官志忠，齊曉嵐.阿爾茨海默病的分子發(fā)病機(jī)制及其治療研究進(jìn)展〔J〕.中華病理學(xué)雜志，2008;37(1):11-5.

2 Borovikova LV，Ivanova S，Zhang M，et al.Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin〔J〕.Nature，2000;5(6785):458-62.

3 Wang H，Yu M，Ochani M，et al.Nicotinic acetylcholine receptorα-7 subunit is an essential regulator of inflammation〔J〕.Nature，2003;421(6921):384-8.

4 Nordberg A，Winblad B.Reduced number of(3H)-nicotine and〔3H〕-acetylcholine binding sites in the frontal cortex of Alzheimer's brains〔J〕.Neurosal Lett，1986;72(1):115-9.

5 Jones S，Sudweeks S，Yakel JL.Nicotinic receptors in the brain:correlating physiology with function〔J〕.Trends Neurosci，1999;22(12):555-61.

6 Dajas-Bailador F，Wonnacott S.Nicotinic acetylcholine receptors and the regulation of neuronal signaling〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004;25(6):317-24.

7 O'Neill MJ，Murray TK，Lakics V，et al.The role of neuronal nicotinic acetylcholine receptors in acute and chronic neurodegenerationl〔J〕.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2002;1(4):399-411.

8 Tracey KJ.Physiology and immunology of the cholinergic anti-inflammatory pathway〔J〕.J Clin Invest，2007;117(2):289-96.

9 Madden KS，Sanders VM，F(xiàn)elten DI.Catecholamine influences and sympathetic neural modulation of immune responsiveness〔J〕.Ann Rev Pharmacol toxicol，1995;35(4):417-48.

10 Calogero S.The lack of chromosomal protein Hmgl does not disrupt cell growth but causes lethal hypoglycaemia in newborn mice〔J〕.Nature Genet，1999;22(2):276-80.

11 Bustin M.At the crossroads of necrosis and apoptosis，signaling to multiple cellular targets by HMGB〔J〕.Sci STKE，2002;151(2):298-311.