姜 楠，周 璐，肖 海，李曉文#

1)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州 450001

mtDNA突變主要引起神經(jīng)肌肉系統(tǒng)退行性病變[1]，可能是亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)、Parkinson、小腦共濟(jì)失調(diào)等多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變發(fā)病的早期信號(hào)[2-5]。mtDNA D環(huán)對(duì)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有重要的控制作用，D環(huán)高變區(qū)點(diǎn)突變與多種惡性腫瘤、糖尿病、衰老等疾病密切相關(guān)[2-5]。作者初步探討mtDNA D環(huán)突變及編碼區(qū)大片段缺失與HD發(fā)生的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象兩個(gè)HD家系均來(lái)自河南省，經(jīng)知情同意后，抽取患者8人、家系內(nèi)正常者20人和家系外正常者20人外周靜脈血各3 mL進(jìn)行檢測(cè)。受檢者均經(jīng)IT-15基因檢查明確診斷。

1.2mtDNAD環(huán)高變區(qū)及編碼區(qū)突變檢測(cè)采用酚-氯法提取外周血全基因組DNA，進(jìn)行PCR。引物序列來(lái)源于GenBank，見表1、2，均由上海生工生物工程有限公司合成。mtDNA D環(huán)高變區(qū)擴(kuò)增體系共50 μL：Mix(含染料)25 μL，上、下游引物各1 μL(終濃度10 μmol/L)，模板DNA 5 μL, ddH2O 18 μL。mtDNA編碼區(qū)反應(yīng)體系共20 μL：Mix(含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL(終濃度10 μmol/L), 模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)攝影并保存圖像。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京金唯智生物公司測(cè)序后，與人類線粒體劍橋序列(Cambridge reference sequence,CRS)進(jìn)行比對(duì)。

表1 高變區(qū)引物序列

表2 編碼區(qū)引物

2 結(jié)果

2.1mtDNAD環(huán)高變區(qū)檢測(cè)結(jié)果所有測(cè)試對(duì)象樣本均有效擴(kuò)增。D環(huán)高變區(qū)Ⅰ、Ⅱ均擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物片段，未見片段缺失或插入突變；測(cè)序結(jié)果與CRS比對(duì)，亦未發(fā)現(xiàn)片段缺失或插入突變。受檢者mtDNA D環(huán)高變區(qū)測(cè)序結(jié)果與CRS比對(duì)結(jié)果見表3～5。其中高變區(qū)Ⅰ的rs16061～rs16171是核苷酸歧變的集中區(qū)域，突變率達(dá)55.6%。

2.2mtDNA編碼區(qū)檢測(cè)結(jié)果3名(37.5%)患者和16名(80.0%)家系內(nèi)正常人mtDNA編碼區(qū)A、B、C、D片段缺失，與CRS比對(duì)分析，缺失類型、位置及缺失片段長(zhǎng)度見表6。

表3 家系外正常人mtDNA D環(huán)高變區(qū)測(cè)序結(jié)果與CRS的比對(duì)(n=20)

表4 家系內(nèi)正常人mtDNA D環(huán)高變區(qū)測(cè)序結(jié)果與CRS的比對(duì)(n=20)

表5 患者mtDNA D環(huán)高變區(qū)測(cè)序結(jié)果與CRS的比對(duì)(n=8)

表6 mtDNA編碼區(qū)大片段缺失類型、位置及缺失片段長(zhǎng)度

3 討論

HD是一種遲發(fā)型神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病因主要是由于IT-15基因CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增，導(dǎo)致其所編碼的亨廷頓蛋白結(jié)構(gòu)與功能異常[6]。線粒體是真核細(xì)胞中能量傳導(dǎo)的細(xì)胞器，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)，mtDNA突變、氧化磷酸化異常及能量代謝障礙均影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能。多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)糖代謝異常和氧化磷酸化系統(tǒng)損傷出現(xiàn)于神經(jīng)元丟失、認(rèn)知功能減退等病理改變之前[4]，說(shuō)明線粒體功能障礙較早參與了多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。

人類mtDNA是一個(gè)雙鏈閉環(huán)DNA分子，含有37個(gè)基因，編碼13種蛋白質(zhì)、22種轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和2種核糖體RNA(rRNA)[7]。 mtDNA不含內(nèi)含子，惟一的非編碼區(qū)是約1 000 bp的D環(huán)，又稱調(diào)控區(qū)，是線粒體基因組和核基因組信息交換的樞紐，包含了1個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)、2個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和4個(gè)保守序列，對(duì)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有重要的控制作用。mtDNA具有高突變率且尤以D環(huán)區(qū)最為常見，包括點(diǎn)突變、片段缺失和插入突變,其16024～16365 nt及73～340 nt兩個(gè)區(qū)域?yàn)槎鄳B(tài)性高發(fā)區(qū)，分別稱為高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ。作者對(duì)HD患者、家系內(nèi)正常人和家系外正常人的mtDNA D環(huán)進(jìn)行突變檢測(cè)，未檢測(cè)到片段缺失或插入，提示mtDNA D環(huán)片段重組可能不是HD發(fā)病機(jī)制中的重要因素。但在rs16139、rs16378、rs16422等位點(diǎn)出現(xiàn)單個(gè)堿基改變，提示這些位點(diǎn)可能與HD的易患性或病程演變有關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大相同母系人員樣本證實(shí)。此外，與CRS相比，家系外正常人mtDNA D環(huán)高變區(qū)Ⅰ變異率可達(dá)80%，而且變異類型較多，其中約55.6%發(fā)生在rs16061～rs16171區(qū)域，該區(qū)域是核苷酸歧變的集中區(qū)域。該結(jié)果提示中國(guó)漢族人的mtDNA序列與CRS可能存在較明顯的種族差異，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究[8]。

有報(bào)道[9]，約62.5% HD患者mtDNA編碼區(qū)存在大片段缺失，缺失類型與CAG三核苷酸重復(fù)無(wú)關(guān)，正常人中未見大片段缺失。作者對(duì)8名患者及20名家系內(nèi)正常人進(jìn)行mtDNA編碼區(qū)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3名HD患者和16名家系內(nèi)正常人存在大片段缺失，未發(fā)現(xiàn)HD與mtDNA編碼區(qū)大片段缺失有特異相關(guān)性，推測(cè)與mtDNA對(duì)表型的閾值效應(yīng)有關(guān)，即家系內(nèi)正常個(gè)體IT-15基因正常，而缺失型mtDNA的數(shù)量未能達(dá)到閾值，因此不表現(xiàn)出明顯的能量代謝障礙。正常個(gè)體出現(xiàn)mtDNA編碼區(qū)大片段缺失的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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