孫 濤，萬大國，宋恒良，孫慎杰

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450014

心肌梗死發(fā)病的主要機(jī)制是心肌缺血，心肌血運(yùn)重建術(shù)已經(jīng)成為治療心肌梗死的主要方法。血管生成是一個受多種信號分子和通路精確調(diào)控的復(fù)雜過程，在多種促血管生成細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞經(jīng)過活化、遷移、增殖，逐步裝配形成管腔。miRNA在許多生物學(xué)過程如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、癌癥發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。最近研究[1]表明，miRNA也參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育和疾病發(fā)生過程。新生血管形成是心肌梗死后心臟修復(fù)的必經(jīng)環(huán)節(jié)。miR-126位于內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)基因 egfl7的第 7 個內(nèi)含子中，與egfl7共同轉(zhuǎn)錄；miR-126 通過抑制兩個血管新生的負(fù)調(diào)控因子Spred-1和 PI3KR的表達(dá)參與血管新生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持血管完整性[2]。他汀類藥物除具有降低血脂的作用外，在急性冠狀動脈綜合征患者中早期應(yīng)用能夠抑制血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣斑塊，改善血管內(nèi)皮功能，具有延緩動脈粥樣硬化(AS)程度、抗炎、保護(hù)神經(jīng)和抗血栓等作用[3]。作者觀察了瑞舒伐他汀對大鼠心肌梗死后梗死組織miR-126的表達(dá)和微血管密度(MVD)的影響，探討其與血管再生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料Trizol購自Invitrogen公司，LA Taq酶、has-miR-126定量PCR檢測試劑盒均購自Transgene公司，其他試劑均為國產(chǎn)試劑。80只清潔級成年SD健康大鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號為SCXK(豫)：2011-0005；雌雄不拘，2～3月齡，體質(zhì)量225～350 g。

1.2實(shí)驗(yàn)分組參照文獻(xiàn)[4-5]的方法，縫扎大鼠左前降支動脈建立急性心肌梗死模型，有62只大鼠存活，術(shù)后24 h采用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組31只。次日起瑞舒伐他汀組給予瑞舒伐他汀10 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃6周，模型組給予等量助溶溶劑連續(xù)灌胃6周。6周中2組各有4只動物死亡，6周后處死動物，取梗死部位心肌組織標(biāo)本。

1.3MVD檢測參照文獻(xiàn)[6]方法計(jì)數(shù)微血管。組織標(biāo)本以體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。采用免疫組化SP法染色，具體方法參照試劑盒(北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)說明書進(jìn)行。高倍鏡下計(jì)數(shù)微血管數(shù)(Ⅷ因子相關(guān)抗原vWF多克隆抗體標(biāo)記)。記錄5個熱點(diǎn)微血管數(shù)，取均數(shù)為最終MVD值。

1.4miR-126表達(dá)水平的測定采用實(shí)時熒光定量PCR法。使用Trizol常規(guī)方法提取組織標(biāo)本RNA，經(jīng)測定完整性和純度后用于實(shí)驗(yàn)。依據(jù)武漢中幟生物科技有限公司提供的方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，莖環(huán)引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATACGACCGCATT，上游引物：5’-GGCTCGTACCGTGAGTAAT-3’，下游引物：5’-GTG CAGGGTCCGAGGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度462 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。實(shí)時熒光定量PCR等操作按試劑盒說明進(jìn)行，采用U6作參考基因，計(jì)算表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較2組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126的表達(dá)量；采用線性相關(guān)分析探討瑞舒伐他汀組大鼠心肌梗死組織2指標(biāo)的關(guān)系。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126表達(dá)水平的比較見表1。

表1 2組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126表達(dá)水平的比較

2.2瑞舒伐他汀組大鼠MVD和miR-126表達(dá)水平的相關(guān)性瑞舒伐他汀組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.720,P=0.026)。

3 討論

他汀類藥物是一種3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的調(diào)整脂代謝紊亂的藥物。Colakoglu和Elewa等[7-8]的研究顯示，臨床常規(guī)劑量的他汀藥對缺血誘導(dǎo)的血管新生表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與PI3K/Akt通路有關(guān)。張?jiān)绿m等[9]研究發(fā)現(xiàn)，給予匹他伐他汀治療14 d后，大鼠缺血后肢新生血管密度較對照組顯著升高。Kikuchi等[10]發(fā)現(xiàn)匹他伐他汀可以通過影響Notch1的表達(dá)促進(jìn)血管新生。Ma等[11]還發(fā)現(xiàn)他汀類藥物對血管新生的影響還具有組織特異性。王東偉等[12]還發(fā)現(xiàn)大劑量瑞舒伐他汀可控制炎癥反應(yīng)。

已知miRNA在心血管系統(tǒng)中高度表達(dá)和特異表達(dá)，其在冠心病的發(fā)病和治療中起重要作用。miR-126也是最新發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)心肌梗死后血管再生的小分子RNA。在哺乳動物，miR-126起源于egfl-7基因的前體結(jié)構(gòu)，miR-126和其宿主基因egfl-7的轉(zhuǎn)錄被轉(zhuǎn)錄因子Ets1調(diào)控[13]。egfl-7是一種分泌蛋白，調(diào)控新生血管內(nèi)皮芽細(xì)胞的移動和定位。Harris等[14]首次闡述了miR-126主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在肺、心臟和肝臟等血管高度豐富的組織中，miR-126的表達(dá)水平也很高。各種各樣的血管生長因子如VEGF或FGF對于梗死后的血管生成起到一定的作用。miR-126作用于VEGF和FGF，增強(qiáng)了血管生成前的反應(yīng)，通過抑制Spred-1(一種Ras/MAP激酶信號通路的細(xì)胞內(nèi)抑制劑)的表達(dá)促進(jìn)血管的生成[15]。該研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀能促進(jìn)心肌梗死后梗死組織血管再生，上調(diào)miR-126的表達(dá)，且血管再生和miR-126的表達(dá)呈正相關(guān)，提示瑞舒伐他汀可能通過上調(diào)miR-126的表達(dá)促進(jìn)心肌梗死大鼠梗死心肌組織的血管再生。

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