饒玉梅，陳 剛，李留霞，李秀芳，余靜麗

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產科 鄭州 450052 2)華中科技大學附屬同濟醫(yī)院婦產科 武漢 430030

以鉑類為基礎的化療在宮頸癌的臨床治療中應用廣泛，然而其化療耐藥仍是臨床中急需解決的問題之一[1]。腫瘤化療耐藥涉及藥物在體內及細胞內的轉運、代謝、細胞的損傷與修復等多個方面。microRNA是一種只有21～25個堿基的非編碼小RNA，廣泛存在于自然界中，研究[2]顯示其在多數人類惡性腫瘤中表達失調，參與細胞的增殖、分化和凋亡等的調節(jié)，也參與腫瘤細胞的化療耐藥。有報道[3-4]miR-106b在小細胞肺癌、前列腺癌等高表達，并影響它們的轉移侵襲功能，而有關其對化療耐藥影響的報道較少，僅見其對睪丸癌順鉑(DDP)耐藥影響的報道[5]。有研究[6]報道m(xù)iR-106b在宮頸癌組織中高表達，但其對宮頸癌生物學行為的影響未見報道，為此，作者進行了如下研究，探討miR-106b對宮頸癌HeLa細胞的DDP化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料宮頸癌HeLa細胞(美國ATTC公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國 Gibco公司)，小牛血清、脂質體2000(美國Life Technologies公司)，DDP、MTT(美國 Sigma 公司)，miR-106b抑制劑、miR-106b類似物及其相應的陰性對照(美國Dharmacon公司)，Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，miR-106b逆轉錄引物及實時定量PCR擴增引物、反轉錄試劑盒、TaqMan MicroRNA試劑盒、U6 snRNA (廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2miR-106b抑制劑、類似物轉染后HeLa細胞中miR-106b的表達將處于對數生長期的HeLa細胞接種于6孔板中。按照脂質體2000說明書進行陰性對照(抑制劑陰性對照組、類似物陰性對照組)，miR-106b抑制劑，miR-106b類似物的轉染，并設置空白對照。轉染6 h后換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。按照Trizol說明書抽提總RNA，應用反轉錄試劑盒，將總RNA反轉錄成cDNA，應用TaqMan MicroRNA試劑盒對合成的cDNA進行實時定量PCR反應，反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，40循環(huán)；以U6為內參照，每組設3個復孔。

1.3miR-106b抑制劑、類似物轉染后細胞對不同濃度DDP敏感性的MTT法檢測細胞培養(yǎng)及分組同1.2。將轉染后的HeLa細胞以5×103個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。24 h后加入濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0和15.0 μmol/L的DDP，每個濃度設3個復孔，培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液(5 g/L)15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100 μL DMSO后振蕩20 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm波長時各孔光密度值(D)。細胞存活率=D(實驗孔)/D(未加DDP對照孔)×100%。

1.4細胞凋亡率的流式細胞儀檢測細胞培養(yǎng)及分組同1.2。依據MTT的結果，選取10 μmol/L DDP作用于各組細胞，然后常規(guī)收集細胞，PBS洗1次，按照Annexin-PI凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.5細胞中目的蛋白表達的Westernblot檢測收獲對數生長期空白對照、轉染miR-106b抑制劑、類似物及陰性對照的細胞，加入100 μL預冷的細胞裂解液30 min，10 000g4 ℃下離心收集上清，二喹啉甲酸法測定提取蛋白的濃度。取100 μg總蛋白進行電泳，電轉儀轉至PVDF膜上；37 ℃、50 g/L脫脂奶封閉1 h，加入Twist1(1100稀釋)、PTEN(11 000稀釋)、p-AKT(Ser473) (11 000稀釋)、β-actin(11 000稀釋)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相應的堿性磷酸酶標記的二抗，常溫孵育1 h，最后NBT/BCIP顯色拍照。以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達量。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行數據分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞中miR-106b表達、細胞存活率、凋亡率以及Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組HeLa細胞中miR-106b的表達結果見表1。

表1 miR-106b抑制劑、類似物轉染后各組細胞中miR-106b的表達

F=5 308.285，P<0.001；*：與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

2.2不同濃度DDP作用48h后各組細胞存活率的變化見表2。與對照組相比，不同濃度DDP作用下，轉染miR-106b抑制劑后HeLa細胞的存活率下降，而轉染miR-106b類似物后HeLa細胞的存活率明顯上升。

2.3 10μmol/LDDP作用下各組細胞凋亡率的比較見表3。與對照組相比，miR-106b抑制劑可以促進細胞凋亡，miR-106b類似物可以抑制細胞凋亡。

2.4各組細胞中Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白的表達見圖1、表4。轉染miR-106b抑制劑后細胞中PTEN蛋白表達升高，Twist1、p-AKT蛋白表達降低；轉染miR-106b類似物后PTEN蛋白表達降低，Twist1、p-AKT蛋白表達增強。

表2 不同濃度DDP作用48 h后各組細胞存活率的變化 (n=3) %

*：與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

表3 10 μmol/L DDP作用下各組凋亡率的比較 %

F=70.807，P<0.001；*：與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

表4 各組細胞中PTEN、Twist1、p-AKT(Ser473)蛋白的表達 (n=3)

*:與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

圖1 各組細胞中PTEN、Twist1、p-AKT(Ser473)蛋白的表達

3 討論

miR-106b的編碼基因定位于染色體7q22.1，其在宮頸癌組織中高表達[6]，且其表達還受人乳頭瘤狀病毒(HPV)的E6、E7蛋白的調節(jié)[7]，而HPV是宮頸癌的致病因素[8]，因此推測其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。作者將miR-106b的抑制劑及類似物轉染HeLa細胞，MTT實驗顯示，當抑制miR-106b表達時，HeLa細胞對DDP的敏感性增強；而過表達miR-106b時，HeLa細胞對DDP的敏感性下降；凋亡檢測也顯示了同樣的結果。

有資料[9]顯示，miR-106b通過調節(jié)TGF-β信號通路而發(fā)揮作用。作者的研究結果顯示miR-106b可以影響Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白的表達。PTEN是一種很重要的抑癌基因，其可影響到腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移侵襲等多方面的功能[10]。當降低miR-106b的表達，可增強PTEN表達，降低p-AKT的表達；當增強miR-106b的表達時，得到相反的效果。因此作者推測，miR-106b可能通過影響PTEN/AKT信號通路，進而影響HeLa細胞對DDP的敏感性。

盡管Twist1是細胞上皮間充質轉化的一個重要的特征分子，在腫瘤細胞侵襲轉移中得到廣泛的研究，但另有報道[11]顯示，Twist1也影響骨肉瘤細胞對DDP的化療敏感性，當增強Twist1的表達，骨肉瘤細胞對DDP的敏感性下降。作者的研究顯示，當增強miR-106b的表達時，Twist1的表達增強；而降低miR-106b的表達時，得到相反的效果。作者的研究結果還顯示增強miR-106b表達，HeLa細胞對DDP的敏感性下降；降低miR-106b表達可增強HeLa細胞對DDP的敏感性。因此作者推測，miR-106b可能通過改變Twist1的表達，影響HeLa細胞對DDP的敏感性。這為miR-106b調控腫瘤細胞對DDP的敏感性的機制研究提供了一個全新的觀點。

綜上所述，miR-106b在宮頸癌HeLa細胞中高表達，其可能通過影響PTEN/AKT信號通路及Twist1的表達來調節(jié)HeLa細胞對DDP的敏感性。當然，以上實驗均為體外實驗，其最終需要體內實驗進一步驗證。鑒于miRNA上、下游調控分子的網絡化、復雜化，miR-106b上游及下游調控分子的研究將是今后作者進一步研究的重點。

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