李春陽，陳 冰，王嬌峰，李艷艷，余大海，胡東生

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 3)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院 深圳 518060

2型糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的主要慢性病之一。多項(xiàng)調(diào)查[1-5]顯示1980年到2001年在中國成年人中其發(fā)病率由1.0% 上升至5.5%，2006年部分農(nóng)村地區(qū)已達(dá)到6.72%。2型糖尿病是由遺傳、環(huán)境等多種因素共同作用導(dǎo)致的多基因遺傳性疾病，具有明顯的家族遺傳傾向。PLIN基因位于15q26.1，含有9個外顯子，與已報道的肥胖、2型糖尿病、高脂血癥的易感基因位置臨近[6]。該研究旨在探討PLIN基因rs2304796及rs894160位點(diǎn)多態(tài)性與河南漢族人群2型糖尿病發(fā)生的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象在河南省的某農(nóng)村社區(qū)以村(組) 為單位，采用隨機(jī)整群抽樣的方法抽取18～80歲的漢族居民為研究對象。研究對象的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)見課題組[3]前期已發(fā)表的論文。調(diào)查時將調(diào)查內(nèi)容告知所有調(diào)查對象，并簽署知情同意書。

1.2現(xiàn)場調(diào)查采用橫斷面調(diào)查方法，調(diào)查內(nèi)容包括問卷調(diào)查、人體測量、血壓測量和血液生化檢測。問卷調(diào)查內(nèi)容、人體基本參數(shù)測定方法、血液生化指標(biāo)測定方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)內(nèi)容見課題組[3]前期已發(fā)表論文。

1.3多態(tài)性檢測

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，由上海英竣生物技術(shù)公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3.2 rs2304796位點(diǎn)多態(tài)性檢測 采用PCR-RFLP技術(shù)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括：10×Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2.0 μL,引物混合物1 μL, DNA聚合酶(大連寶生物工程公司)0.2 μL, DNA模板2.0 μL(10 μg/L),ddH2O 17.3 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min, 35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶(MBI公司)酶切，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，顯示334、220和114 bp 3個片段為CT型，220和114 bp兩個片段為CC型，334 bp一個片段為TT型。

1.3.3 rs894160位點(diǎn)多態(tài)性檢測 應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)。反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgC121.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1.5 μL,引物1 μL,DNA聚合酶0.3 μL, DNA模板2.0 μL(10 μg/L), 20×EvaGreen 0.625 μL,ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s, 40個循環(huán)；在72 ℃收集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動分析、顯示熔解曲線和擴(kuò)增曲線，并顯示Ct值和熔解溫度Tm，與上游引物1和2相對應(yīng)平行管的Ct值分別為Ct1、Ct2，根據(jù)ΔCt(ΔCt=|Ct1-Ct2|)值進(jìn)行基因分型。ΔCt≤3為雜合子，ΔCt≥6為純合子。上游引物1參與反應(yīng)的熒光信號顯著高于上游引物2參與反應(yīng)的熒光信號為GG純合子基因型；反之為AA純合子基因型。質(zhì)量控制：每次檢測設(shè)置2個空白對照，以2個重復(fù)標(biāo)本作為陽性對照；隨機(jī)抽取5%樣本進(jìn)行盲法復(fù)測，檢驗(yàn)結(jié)果一致率100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理調(diào)查數(shù)據(jù)用EpiData 3.12軟件進(jìn)行平行雙錄入，并進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。使用SAS 9.13處理數(shù)據(jù)。2型糖尿病患者和非患者基本特征的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用Unphased 3.0.7軟件構(gòu)建單倍型；用logistic回歸模型評估調(diào)整協(xié)變量后的基因型與2型糖尿病的關(guān)系，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1一般情況共調(diào)查1 274人，其中符合要求、資料完整的2型糖尿病患者161人，年齡19～79(55.6±11.5)歲，非患者1 113人，年齡18～79(50.0±13.7)歲。2型糖尿病患者與非患者的基本特征見表2。

表2 2型糖尿病患者和非患者基本特征 例(%)

*：部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失。

2.2 2組人群PLIN基因rs2304796、rs894160位點(diǎn)多態(tài)性檢測結(jié)果rs2304796位點(diǎn)共檢出CC、CT和TT 3種基因型，rs894160位點(diǎn)共檢出GG、GA和AA 3種基因型。2組人群PLIN基因rs2304796、rs894160位點(diǎn)多態(tài)性分布特征比較見表3、4。

2.3 2組人群PLIN基因rs2304796、rs894160位點(diǎn)單倍型比較見表5。

表3 2組人群PLIN基因rs2304796位點(diǎn)多態(tài)性分布 例(%)

*:調(diào)整了年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、經(jīng)濟(jì)收入、肥胖、血脂測量指標(biāo)等因素。

表4 2組人群PLIN基因rs894160位點(diǎn)多態(tài)性分布 例(%)

*：調(diào)整了年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、經(jīng)濟(jì)收入、肥胖、血脂測量指標(biāo)等因素。

表5 2組人群PLIN單倍型頻率的比較

*：調(diào)整了年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、經(jīng)濟(jì)收入、肥胖、血脂測量指標(biāo)等。

3 討論

人類PLIN基因編碼產(chǎn)生Perilipin A、B、C、D4種亞型蛋白，其中Perilipin A含量最多，特異性表達(dá)于脂肪細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞中，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中甘油三酯的存儲與分解[7-8]。研究[9-10]表明PLIN基因多態(tài)性與代謝綜合征相關(guān)指標(biāo)如肥胖有關(guān)聯(lián), 而該基因多態(tài)性與2型糖尿病關(guān)系研究較少。

PLIN多態(tài)基因型的分布頻率存在種族和地域差異。據(jù)報道[9-12]，法國健康人群PLIN rs894160變異等位基因頻率為29.37%，西班牙人為26.2%,美國白人為27.0%，新加坡華人為42.0%，新加坡馬來西亞人為43.0%，新加坡印度人為31.0%。該研究結(jié)果顯示，河南漢族非糖尿病人群中PLIN rs894160變異等位基因(A)頻率為35.71%，PLIN rs2304796變異等位基因(T)頻率為33.18%，高于現(xiàn)有對中國漢族人群研究報告的28.28%[13]。

Qi等[9]發(fā)現(xiàn)西班牙白人女性中PLIN rs2304796位點(diǎn)與血糖變化無關(guān)。該研究結(jié)果顯示，河南漢族人群中PLIN基因rs2304796位點(diǎn)在顯性模型中，CC和CT+TT基因型頻率在2型糖尿病患者和非患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Logistic回歸模型分析結(jié)果提示，在調(diào)整了年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、經(jīng)濟(jì)收入、肥胖、血脂測量指標(biāo)等因素后，PLIN基因rs2304796位點(diǎn)與2型糖尿病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，T攜帶者發(fā)生2型糖尿病的危險度是CC型攜帶者的0.670倍(95%CI為0.475～0.944)，CT和TT基因型可降低2型糖尿病發(fā)生的風(fēng)險。Qi等[9]發(fā)現(xiàn)在西班牙白人女性中PLIN基因rs894160位點(diǎn)AA基因型與低血糖有關(guān)，而Wang等[14]研究表明臺灣人群中攜帶PLIN基因rs894160位點(diǎn)AA基因型者患2型糖尿病風(fēng)險較高。該研究結(jié)果顯示，在河南漢族人群中雖然攜帶rs894160位點(diǎn)(GA+AA)基因型者患2型糖尿病風(fēng)險是GG基因型的1.207倍，但95%CI為0.851～1.713，提示PLIN基因rs894160位點(diǎn)突變與2型糖尿病發(fā)生危險性無關(guān)。

總之，該研究結(jié)果提示PLIN基因rs2304796位點(diǎn)多態(tài)性在河南漢族人群2型糖尿病發(fā)生過程中可能具有重要作用。該研究非糖尿病患者存在混雜因素，因此研究具有一定局限性。此外，由于PLIN基因變異存在種族差異，作者僅選擇一個地區(qū)的漢族人群，難免存在選擇性偏倚，因此要確定PLIN基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系，尚需繼續(xù)搜集樣本再研究。

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