王瑞華，謝建國，付 強，謝 天，馬 杰，常玉璽

1)上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科 上海 201499 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科 鄭州 450008 3)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450008

腫瘤的血管生成受到多種血管生成因子的調(diào)控，近年來，越來越多的研究關(guān)注促血管生成素家族，尤其促血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)[1]。Ang-2是Tie/angiopoeitin信號通路的一部分，涉及血管的形成和發(fā)育。Ang-2及其特異性酪氨酸激酶受體-2(tyrosine kinase receptor-2，Tie-2)是腫瘤血管生成的重要調(diào)節(jié)因子[2]。Ang-2/Tie-2信號通路激活將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，誘導(dǎo)血管生成[3]。ras基因是最常見的癌基因，它由K-ras、H-ras和N-ras家族組成。研究[4]表明K-ras為大腸癌轉(zhuǎn)化基因，其突變是大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中早期分子事件之一。作者對結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA的表達及K-ras基因突變進行檢測、分析，探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1組織來源標本來自鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科2010年6月至2011年6月經(jīng)手術(shù)切除、病理證實的結(jié)直腸腺癌40例，10例正常大腸組織取自切除腸段的斷端。其中男21例，女19例，年齡27～78歲。高中分化癌31例，低未分化癌9例；Dukes分期：A期4例，B期19例，C期13例，D期4例；大體類型：隆起型22例，潰瘍型16例，浸潤型2例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例(包括肝轉(zhuǎn)移4例)；浸潤深度：浸潤至肌層14例，浸潤至漿膜層26例。將組織標本裝于凍存管中，迅速置于液氮中保存待檢。

1.2試劑及儀器oligo-(dT)(TaKaRa D510)，Ribonuclease Inhibitor(TaKaRa D2310A)，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega M170A)，RNA抽提試劑盒、BioEasy SYBR Green Ⅰ Real-time PCR試劑盒(北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。其余生化試劑均為進口分析純。Line-gene 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日科技有限公司)，DYY-7C型電泳儀及紫外分析儀(北京六一儀器廠)，DYCP-31D型水平式電泳槽(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)。

1.3Ang-2、Tie-2mRNA的檢測采用Real-time PCR法。將組織在液氮中磨碎，裂解勻漿處理后，提取總RNA，取3 μL逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板行Real-time PCR。所用引物由北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系: 2×SYBR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，蒸餾水20.7 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA 2 μL。以B2微球蛋白(B2-MG)為內(nèi)參。反應(yīng)程序:95 ℃ 120 s；95 ℃ 20 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)。記錄每個循環(huán)反應(yīng)管中的熒光信號值，并描繪曲線。記錄達閾值的最低循環(huán)數(shù)(Ct值)，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達量[5]。

1.4K-ras基因突變的檢測采用PCR-SSCP方法。將液氮保存的組織勻漿用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，冷無水乙醇沉淀，0.1×TE溶解，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。K-ras基因PCR引物序列參照文獻[2]，由北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司合成，序列見表2。以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)總體積50 μL，于PCR循環(huán)儀94 ℃變性75 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL與等量加樣緩沖液混合，98 ℃變性10 min，冰浴驟冷5 min，然后加樣在80 g/L聚丙烯酰胺凝膠上電泳5 h,銀染鑒定。

表1 Ang-2、Tie-2及內(nèi)參PCR引物序列

表2 K-ras及內(nèi)參PCR引物序列

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0進行數(shù)據(jù)分析。正常和癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA表達量的比較，以及K-ras基因突變和未突變癌組織中兩者mRNA表達量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，對癌組織中Ang-2和Tie-2 mRNA表達量行Pearson相關(guān)分析，不同臨床病理特征的癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA高表達率及K-ras基因突變率的比較采用χ2檢驗或精確概率法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2mRNA的表達

Ang-2、Tie-2 mRNA溶解曲線都為單峰，說明各基因擴增產(chǎn)物純凈，未擴增出非特異性產(chǎn)物。Ang-2、Tie-2 mRNA擴增曲線都呈典型S型，說明各基因產(chǎn)物擴增正常。Ang-2、Tie-2 mRNA在正常組織中的表達量均為1，癌組織中分別為(2.92±0.23)、(2.17±0.15)，均較正常組織明顯增高(t=39.960、9.490，P<0.001)。結(jié)直腸癌組織中Ang-2 mRNA與Tie-2 mRNA表達量呈線性正相關(guān)(r=0.772，P<0.001)。以Ang-2、Tie-2 mRNA表達量高于2.92和2.17為高表達，則兩者高表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系見表3。

表3 Ang-2、Tie-2 mRNA高表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

*：校正χ2。

2.2結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變檢測結(jié)果40例結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率為42.5%(17/40)。突變的17例中，11例為12密碼子由GGT到GAT突變，6例為13密碼子由GGC到GAC突變。不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率的比較見表4。

表4 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率的比較

*：精確概率法。

2.3結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變與Ang-2、Tie-2mRNA表達的關(guān)系見表5。

表5 結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變與Ang-2、Tie-2 mRNA表達的關(guān)系

3 討論

Ang-2位于人類染色體的8p23.1，其受體為Tie-2，該受體的磷酸化參與血管生成的延續(xù)過程，使血管成熟穩(wěn)定。有研究[6]表明Ang-2的表達是腫瘤性血管新生起始的強化因素，與腫瘤性血管生成的數(shù)目和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ang-2與Tie-2受體特異性地結(jié)合，可拮抗Ang-1穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)的作用，消除血管基底膜和周圍間質(zhì)細胞對血管形成的限制，并增加內(nèi)皮細胞對內(nèi)皮生長因子等血管增殖因素的敏感性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分裂、萌芽、遷移，從而促進血管生成，血管增生顯著，管壁通透性明顯增加，繼而導(dǎo)致了高度不穩(wěn)定滲漏性、不成熟性及內(nèi)皮細胞高度增殖的腫瘤血管持續(xù)生成[7]。研究[8]表明，Ang-2是一個獨立的指標，可用于臨床評價肝細胞癌患者的病情，與腫瘤大小和患者的生存密切相關(guān)。有研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，Ang-2過度表達可導(dǎo)致肺腫瘤不受控制的轉(zhuǎn)移；抑制Ang-2則可減少腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和自發(fā)性腫瘤的發(fā)生；Ang-2是非常有希望的腫瘤治療靶點。

K-ras基因突變點固定在12、13和61密碼子，其中以12位密碼子突變最常見。作為一種原癌基因，K-ras基因突變在結(jié)直腸細胞癌變的早期即被啟動，突變產(chǎn)生具有致癌活性的P21蛋白，通過Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游信號分子，持續(xù)刺激細胞生長、發(fā)育、增殖，引起細胞惡變。K-ras基因的激活有多種表現(xiàn)形式，可以是表達增加或是基因突變或是內(nèi)在的GTP酶活性下降。

該研究結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA的表達明顯上調(diào)，兩者的表達量呈線性正相關(guān)，且兩者表達量與腫瘤的浸潤深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度有關(guān)，與Goede等[13]研究結(jié)果相同。研究結(jié)果還顯示，40例結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率為42.5%，K-ras基因突變與性別、腫瘤細胞的浸潤深度等無明顯相關(guān)，但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者K-ras基因突變率高于無轉(zhuǎn)移者，Dukes分期C、D期者K-ras基因突變率高于A、B期。作者還發(fā)現(xiàn)，K-ras基因突變的結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA表達量高于無突變者，提示K-ras基因突變可能通過促進腫瘤血管的生成，參與了結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。

總之，Ang-2、Tie-2系統(tǒng)在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移機制和未來的治療靶點方面值得進一步研究；K-ras基因作為分子生物學(xué)指標，對判斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后具有重要意義。

[1]Laurén J, Gunji Y, Alitalo K. Is angiopoietin-2 necessary for the initiation of tumor angiogenesis? [J]. Am J Pathol, 1998，153(5): 1333

[2]Huang H, Bhat A, Woodnutt G, et al. Targeting the ANGPT-TIE2 pathway in malignancy[J]. Nat Rev Cancer，2010，10(8): 575

[3]Saharinen P, Eklund L, Pulkki K, et al. VEGF and angiopoietin signaling in tumor angiogenesis and metastasis[J]. Trends Mol Med，2011，17(7): 347

[4]Mannan A, Hahn-Stromberg V. K-ras mutations are correlated to lymph node metastasis and tumor stage, but not to the growth pattern of colon carcinoma[J]. APMIS, 2012,120(6): 459

[5]張俊，羅娜，王勃，等.上調(diào)microRNA-150表達對肝癌SMMC7721細胞增殖和凋亡的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37(10)：943

[6]Fagiani E, Lorentz P, Kopfstein L, et al. Angiopoietin-1 and -2 exert antagonistic functions in tumor angiogenesis, yet both induce lymphangiogenesis[J]. Cancer Res, 2011,71(17): 5717

[7]Gevertz JL, Torquato S. Modeling the efects of vasculature evolution on early brain tumor growth[J]. J Theor Biol, 2006,243(4): 517

[8]Kuboki S, Shimizu H, Mitsuhashi N, et al. Angiopoietin-2 levels in the hepatic vein as a useful predictor of tumor invasiveness and prognosis in human hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2008,23(7 Pt 2):e157

[9]Holopainen T, Saharinen P, D’Amico G, et al. Effects of angiopoietin-2 blocking antibody on endothelial cell-cell junctions and lung metastasis[J]. J Natl Cancer Inst,2012,104(6): 461

[10]Paez-Ribes M, Allen E, Hudock J, et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis[J]. Cancer Cell, 2009,15(3): 220

[11]Ebos JM, Lee CR, Cruz-Munoz W, et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis[J]. Cancer Cell,2009,15(3): 232

[12]Mazzieri R, Pucci F, Moi D, et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells[J]. Cancer Cell,2011,19(4): 512

[13]Goede V, Coutelle O, Neuneier J, et al. Identification of serum angiopoietin-2 as a biomarker for clinical outcome of colorectal cancer patients treated with bevacizumab-containing therapy[J]. Br J Cancer, 2010,103(9): 1407