蘇 靜，馮 嵩，葛 薇，劉 娜，安金斗

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科 鄭州 450052

心力衰竭是各種心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一種綜合征，兒科常見于大型室間隔缺損、動脈導(dǎo)管未閉等先天性心臟病導(dǎo)致的右心衰竭。心臟經(jīng)歷了缺血缺氧、心肌肥厚、心室重塑，最終導(dǎo)致心力衰竭。心肌纖維化是心室重塑的重要表現(xiàn)之一，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是近年來發(fā)現(xiàn)的心肌纖維化過程中的重要生物活性物質(zhì)，同時(shí)與心肌肥厚密切相關(guān)[1]。有報(bào)道[2]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)可降低血清TGF-β1，改善心功能。磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)5抑制劑可對抗超載所致的多條心肌肥大通路的激活以改善心臟的功能[3]，其作用機(jī)制尚不十分明確。關(guān)于二者用于右心衰竭治療的療效是否相同及聯(lián)合應(yīng)用的效果如何，研究報(bào)道甚少。為此，作者進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1動物、試劑和儀器SD幼年大鼠78只，4周齡，體質(zhì)量85～105 g，雄性，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心?？ㄍ衅绽?中美上海施寶有限公司，批號：1109031)，西地那非(輝瑞制藥有限公司，批號：1183026)，野百合堿(MCT，上海惠城生物科技有限公司，批號：1109027)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗大鼠多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，德國Lecia顯微照相系統(tǒng)，Biosens數(shù)字影像系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)，354CE型酶標(biāo)儀(芬蘭Themo Electron公司)。

1.2動物模型建立及分組將MCT粉劑加入乙醇和生理鹽水混合液[V(乙醇)V(生理鹽水)= 28]配成10 g/L溶液。78只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=20)和模型組(n=58)。模型組以30 mg/kg劑量腹腔注射MCT，對照組腹腔注射生理鹽水。至4周右心衰竭模型形成，對照組又隨機(jī)分為正常對照4周組(N1組，n=10)和正常對照6周組(N2組，n=10)。模型組有3只死亡，余55只隨機(jī)分為心衰4周組(F1組，n=11)、心衰6周組(F2組，n=11)、卡托普利治療組[C組，5 mg/(kg·d)，n=11]、西地那非治療組[S組，10 mg/(kg·d)，n=11]、兩藥聯(lián)合治療組(C+S組，n=11)。C組、S組、C+S組從第5周開始給藥，每天早晨1次灌胃至第6周。N2組、F2組同時(shí)給予等量蒸餾水灌胃。

1.3血液及組織標(biāo)本的留取于4周或6周末抽取循環(huán)血液3 mL，然后將動物處死，完整切取肝臟、心臟，冰鹽水沖洗。稱量肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟與體質(zhì)量的比值，即肝臟系數(shù)。修剪心臟，分別稱量右室、左室加室間隔的質(zhì)量，計(jì)算右室與左室加室間隔的比值×100%(即右室肥厚指數(shù))和左室與體質(zhì)量的比值。切取部分右室心肌組織用40 g/L多聚甲醛固定。

1.4血清TGF-β1的檢測將抽取的血液迅速4 ℃離心5 min(4 000 r/min)，取血清，采用ELISA法檢測TGF-β1水平。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的含量。

1.5心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)的免疫組化法檢測心肌標(biāo)本3 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水，PBS沖洗，抗原加熱修復(fù)，室溫冷卻，PBS緩沖液漂洗，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫20 min，操作步驟按SP試劑盒進(jìn)行。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色為陽性表達(dá)。采用Biosens數(shù)字圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，測定陽性區(qū)的吸光度和面積，以兩者的乘積表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，定量資料均進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或校正的t檢驗(yàn)；卡托普利或西地那非對模型組各指標(biāo)影響應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析；應(yīng)用pearson積差相關(guān)系數(shù)分析F2組大鼠血清和右室心肌TGF-β1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)變化第1周模型組大鼠與對照組在精神狀態(tài)、活動量、進(jìn)食、體質(zhì)量增加方面無差異。第2周后模型組大鼠精神狀態(tài)較對照組差，活動量、進(jìn)食較對照組少，體質(zhì)量增長緩慢。4周時(shí)對照組大鼠20只全部存活，模型組大鼠有3只死于嚴(yán)重心衰，存活者均表現(xiàn)為精神萎靡，被毛蓬松無光澤，靜息狀態(tài)下呼吸急促，食欲低下，活動量明顯較少等心力衰竭癥狀。6周末N2組全部存活，F(xiàn)2、C、S及C+S組各存活10只。

2.2模型組大鼠右室心肌細(xì)胞的變化4周時(shí)F1組大鼠右室心肌切片見心肌細(xì)胞排列紊亂，部分肌漿溶解，可見空泡變性，F(xiàn)2組變化更明顯，見圖1。

2.3 4周與6周時(shí)各觀察指標(biāo)的比較見表1、2和圖2。

2.4藥物干預(yù)對各觀察指標(biāo)的影響見表3。

2.5F2組大鼠血清和右室心肌TGF-β1蛋白表達(dá)的相關(guān)性相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)2組大鼠血清TGF-β1水平和右室心肌TGF-β1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，r=0.665，P<0.001。

圖1 右室心肌細(xì)胞形態(tài)變化(HE，×400)

表1 4周時(shí)各觀察指標(biāo)的比較

表2 6周時(shí)各觀察指標(biāo)的比較

*：與表1中F1組比較，t=0.189，P<0.001；#：與表1中F1組比較，t=3.931，P=0.002。

圖2 右室心肌TGF-β1蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表3 6周末模型組大鼠各觀察指標(biāo)比較

3 討論

根據(jù)作者[4]以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)采用單劑量MCT腹腔注射的方法建立右心衰竭模型。MCT在肝臟內(nèi)經(jīng)單氧化酶轉(zhuǎn)化后，通過血液循環(huán)到達(dá)肺，引起作為靶細(xì)胞的肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞不可逆損傷及繼發(fā)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺血管重塑及肺動脈高壓，逐漸形成右心衰竭。該實(shí)驗(yàn)中4周后幼鼠出現(xiàn)右心衰竭的表現(xiàn)，與對照組相比，肝臟系數(shù)、右室肥厚指數(shù)明顯升高，光鏡下觀察右心室心肌切片示心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維分叉，核濃染，部分肌漿溶解，并可見空泡變性，說明右心衰竭模型構(gòu)建成功。

TGF-β1是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞因子，它能使Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白等mRNA及蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生[5]。研究[6]證實(shí)其在心肌纖維化的形成中起關(guān)鍵作用。

心衰時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活是其進(jìn)展的主要原因，主要表現(xiàn)為RASS系統(tǒng)的激活。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)通過刺激TGF-β1合成，促進(jìn)細(xì)胞肥大和纖維化發(fā)生。給予TGF-β1基因缺陷小鼠AngⅡ后未發(fā)現(xiàn)明顯的左室心肌肥大和纖維化[7]。ACEI通過阻斷血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)減少AngⅡ的生成。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，右心衰竭大鼠肝臟系數(shù)、右室肥厚指數(shù)明顯升高，血清TGF-β1、右室心肌TGF-β1蛋白表達(dá)較對照組顯著升高；6周時(shí)心衰組大鼠TGF-β1的水平較4周時(shí)升高明顯，應(yīng)用卡托普利后上述指標(biāo)均改善。提示TGF-β1參與右心衰竭時(shí)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，其水平與右心衰竭程度相關(guān)，卡托普利可通過降低TGF-β1而改善心功能。

PDE是細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP、cGMP降解的關(guān)鍵酶，PDE5是這個(gè)超家族成員之一，以往認(rèn)為PDE5在心肌表達(dá)量很少，所以不可能起到重要的生理作用。新近研究[8]發(fā)現(xiàn)，在人和動物中，正常的右室心肌不表達(dá)PDE5，但PDE5 mRNA及其蛋白在肥大的右室心肌中高度表達(dá)，PDE5抑制劑可有效增加心肌收縮力，降低后負(fù)荷，但不影響體循環(huán)血流動力學(xué)。西地那非是特異的PDE5抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與cGMP相似，可以與cGMP競爭PDEs的結(jié)合部位，從而抑制cGMP水解，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平上升。cGMP可以激活cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)-激活K+通道，進(jìn)而抑制鈣離子通道，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的減低[9]。有報(bào)道[10]心衰患者口服西地那非可提高運(yùn)動耐量，改善右心功能。該實(shí)驗(yàn)中給予西地那非后，右室肥厚指數(shù)較心衰組下降，提示右心肥厚有所減輕，可能與西地那非抑制鈣離子通道，降低了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，引起肺血管舒張，后負(fù)荷降低有關(guān)。同時(shí)血清TGF-β1、右室心肌TGF-β1蛋白亦下降，說明西地那非可抑制TGF-β1的表達(dá)，但其抑制TGF-β1表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示血清TGF-β1和右室心肌TGF-β1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示TGF-β1的血清水平能夠反映出右室心肌TGF-β1表達(dá)的變化，臨床可通過測定血清TGF-β1含量判斷心力衰竭的嚴(yán)重性。然而關(guān)于其與心力衰竭嚴(yán)重程度的相關(guān)性國內(nèi)報(bào)道不一：謝亞芹等[11]的研究表明心力衰竭大鼠TGF-β1蛋白高于假手術(shù)組，且隨著心力衰竭程度的加重而表達(dá)增多，與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；但楊震等[12]研究顯示CHF患者血清TGF-β1較正常對照組明顯降低，且與心力衰竭的嚴(yán)重程度有顯著的相關(guān)性，TGF-β1濃度越低，心力衰竭越嚴(yán)重；國外Glazer等[13]在對老年人的心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn)血清高水平TGF-β1與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)。因此，關(guān)于TGF-β1在心力衰竭患者中的變化有待臨床大樣本研究。

先天性心臟病合并艾森曼格綜合征患者口服西地那非或波生坦均可以改善血流動力學(xué)指標(biāo)，提高運(yùn)動耐量，二者聯(lián)合應(yīng)用未優(yōu)于單用[14]。該實(shí)驗(yàn)中卡托普利、西地那非均可以通過抑制TGF-β1的表達(dá)減輕心室肥厚，改善心功能，二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。目前臨床上尚未見二者聯(lián)合應(yīng)用的療效研究，關(guān)于聯(lián)用的療效及有何副作用有待進(jìn)一步臨床研究。

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