侯桂琴，貝維娟，楊 帥，王瓊?cè)~，魯照明#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)系 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科 鄭州 450052

PTEN(phosphatase and tensine homolog deleted on chromosome 10)基因是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10[1]，通過雙磷酸酶活性對(duì)多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行去磷酸化調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控。它的主要功能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和黏附以及參與胚胎正常發(fā)育和維護(hù)免疫系統(tǒng)穩(wěn)定性[2-3]。PTEN在很多腫瘤組織中缺失或低表達(dá)，尤其在子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤等惡性腫瘤組織中突變率較高[4-5]。PTEN基因的突變、失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4,6]。食管鱗癌是最常見的惡性腫瘤之一，有報(bào)道[7]證實(shí)食管鱗癌組織中存在PTEN缺失或低表達(dá)。作者采用RT-PCR方法檢測(cè)了EC9706、Eca109和EC1等3種食管鱗癌細(xì)胞株細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)水平，然后從這3株細(xì)胞中克隆出PTEN基因全長(zhǎng)并分析其突變位點(diǎn)，為探討PTEN在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及食管鱗癌的基因診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑EC9706購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫，EC1、Eca109及大腸桿菌JM109由課題組長(zhǎng)期保存；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；pcDNA3.1(+)載體購(gòu)自Invitrogen公司；pMD18-T載體、BamHⅠ、HindⅢ、一步法RNA PCR試劑盒、Taq酶、dNTP、DNA Marker、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自大連寶生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)3種細(xì)胞均用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4PTENmRNA的RT-PCR檢測(cè)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，用甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。將總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PTEN檢測(cè)引物行PCR。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中含cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用BandScan 5.0對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度分析，以目的基因與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.5PTEN全基因序列的擴(kuò)增提取細(xì)胞總RNA，采用一步法RNA PCR試劑盒,按照操作說明擴(kuò)增細(xì)胞中PTEN全基因序列。PCR擴(kuò)增條件: 50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。取 5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6PTEN基因突變位點(diǎn)的分析用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收全基因序列擴(kuò)增的目的片段，與pMD18-T 載體16 ℃連接過夜,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-PTEN。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109受體菌，然后將其涂布于含50 mg/L氨芐西林(Amp) 的LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)14～16 h。從平板上隨機(jī)挑取白色菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。提質(zhì)粒，HindⅢ和BamHⅠ 37 ℃雙酶切。把酶切鑒定正確的質(zhì)粒送生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank上野生型PTEN基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析突變位點(diǎn)。為了減少誤差，每個(gè)質(zhì)粒同時(shí)分別送3家公司測(cè)序，將兩家以上公司測(cè)出的共同突變點(diǎn)作為基因突變位點(diǎn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)。3株細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3株食管鱗癌細(xì)胞中PTENmRNA的表達(dá)水平提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖電泳顯示18S、28S兩條帶(圖1)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A(260 nm)/A(280 nm)>1.8，說明RNA的純度和完整性符合PCR要求。RT-PCR結(jié)果(圖2)顯示，EC1、EC9706、Eca109細(xì)胞中PTEN mRNA 的表達(dá)水平分別為(0.06±0.02)、(0.24±0.02)、(0.41±0.01)，3株細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=306.330，P<0.001)，Eca109細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)水平高于EC9706和EC1細(xì)胞(P<0.05)。

圖1 3株細(xì)胞總RNA提取結(jié)果

圖2 3株細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)

2.2PTEN全基因序列擴(kuò)增結(jié)果采用一步法RNA PCR試劑盒擴(kuò)增PTEN基因，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(圖3)，可在1 500 bp附近見到一清晰的條帶。

圖3 3株細(xì)胞中PTEN全基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 3株食管鱗癌細(xì)胞中PTEN基因突變位點(diǎn)分析將重組質(zhì)粒pMD18-PTEN轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌JM109后，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，可以觀察到1 500 bp和3 000 bp附近各有一條清晰的條帶(圖4)。將測(cè)序結(jié)果與野生型PTEN基因序列比對(duì)，找出從起始密碼子(ATG)開始到終止密碼子(TGA)間的突變，即編碼區(qū)的突變。3株細(xì)胞的突變位點(diǎn)見表1～3。

圖4 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

表1 EC9706細(xì)胞PTEN基因突變分析

表2 Eca109細(xì)胞PTEN基因突變分析

表3 EC1細(xì)胞PTEN基因突變分析

3 討論

PTEN基因是1997年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，該基因包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子[1-2]。PTEN cDNA編碼的蛋白由403個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約55 000[1-2]。PTEN蛋白有兩個(gè)比較重要的結(jié)構(gòu)域：C端磷酸酶結(jié)構(gòu)域和N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域。C端結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)催化區(qū)，它的結(jié)構(gòu)與雙特異性磷酸酶相似，可使 3, 4, 5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3) 和局部黏附激酶(FAK) 去磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2,8]。N端結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞骨架蛋白tensine和auxilin高度同源，這一特點(diǎn)在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到了重要作用。因此PTEN的主要作用為：抑制細(xì)胞的遷移、延伸和局部黏附；參與胚胎正常發(fā)育，通過阻滯細(xì)胞于G1期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及端粒酶活性等[9]。

許多研究證實(shí)PTEN mRNA表達(dá)隨細(xì)胞分化程度降低而降低。Zainuddin等[10]報(bào)道影響PTEN mRNA表達(dá)的因素復(fù)雜，一方面各種轉(zhuǎn)錄因子活性可對(duì)PTEN mRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，另一方面PTEN 5’端的非翻譯序列也可影響其轉(zhuǎn)錄，此外5’端CPG島甲基化可封閉轉(zhuǎn)錄。Weng等[11]報(bào)道，通過對(duì)前列腺癌細(xì)胞的去甲基化可以恢復(fù)PTEN mRNA 的表達(dá)水平，由此得出啟動(dòng)子區(qū)的甲基化可能是PTEN表達(dá)降低或缺失的原因之一。作者的檢測(cè)結(jié)果也顯示，高分化的Eca109細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)水平明顯高于其他兩種低分化食管鱗癌細(xì)胞EC9706和EC1，說明在食管鱗癌細(xì)胞中，PTEN mRNA的表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān)，其表達(dá)水平隨著分化程度的降低而降低，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

PTEN是繼p53基因之后，又一個(gè)突變率高且與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系的抑癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)PTEN基因在多種腫瘤中存在突變，如乳癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肺癌、腎癌、肝癌等[5, 12-13]。PTEN基因一旦發(fā)生突變，其磷酸酶活性就會(huì)顯著降低，從而失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控，使得腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[14]。作者的研究結(jié)果顯示，從3株食管鱗癌細(xì)胞中克隆出的PTEN基因均存在外顯子的突變，且突變均為錯(cuò)義突變或無義突變。EC9706細(xì)胞PTEN基因突變出現(xiàn)在第2、5、6、8外顯子，其中第5和第8外顯子各出現(xiàn)兩處突變；而Eca109細(xì)胞PTEN基因突變出現(xiàn)在第5、8和9外顯子；EC1細(xì)胞PTEN基因突變出現(xiàn)在第6、8、9外顯子。研究結(jié)果證實(shí)在食管鱗癌細(xì)胞中PTEN基因突變位點(diǎn)多出現(xiàn)在第5、8外顯子，這與國(guó)外報(bào)道的PTEN在其他腫瘤中的突變熱點(diǎn)集中在第5、8外顯子基本相符[15]。

綜上所述，作者推測(cè)PTEN基因突變?cè)谑彻荀[癌的發(fā)生中起著重要的作用。今后作者將進(jìn)一步通過定位突變技術(shù)，對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中PTEN基因突變進(jìn)行深入研究，以了解PTEN基因突變尤其是熱點(diǎn)突變?nèi)绾尉唧w影響其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而探討PTEN突變?cè)谑彻荀[癌發(fā)生中的具體作用。

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