吳 非 羅 濤 郭遠瑾 梅元武

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)最重要的固有免疫細胞和主要的效應細胞，它在AD、帕金森病、多發(fā)性硬化的免疫反應中既能分泌神經(jīng)毒性因子又能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，表現(xiàn)出促炎及抗炎的雙重作用，表現(xiàn)為M1型和M2型兩種極化狀態(tài)［1～3］。因此，干預小膠質(zhì)細胞的極化狀態(tài)對于調(diào)整神經(jīng)系統(tǒng)免疫應答進而干預疾病病程極具研究意義的。近年來，通過深入研究證實他汀類藥物除了降脂作用外，還有重要的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠抑制多種炎性因子的表達，已經(jīng)在如多發(fā)性硬化等免疫性疾病中用以臨床研究［4］，但究其抗炎機制仍未有確定結(jié)論。本實驗通過辛伐他汀干預脂多糖（LPS）誘導的BV2小膠質(zhì)細胞，檢測小膠質(zhì)細胞M1和M2型兩種極化狀態(tài)分泌因子及相關(guān)分子標志的變化，研究辛代他汀對于小膠質(zhì)細胞不同表型的影響，為進一步闡明辛伐他汀的免疫調(diào)節(jié)機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BV2細胞購自中國科學院基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心，無菌PBS、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清等細胞培養(yǎng)所需主要試劑均為HyClone公司，LPS購自Sigma公司，Real－time PCR（實時熒光定量）相關(guān)試劑盒購買于大連TaKaRa公司，小鼠TNF－αELISA 試劑盒為欣博盛科技有限公司產(chǎn)品。小鼠IL－10、IL－12ELISA 檢測試劑盒、FITC 標記抗小鼠CD206抗體購自Biolegend公司。

1.2 引物 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，本實驗所用各引物序如下：

基因 引物序列iNOS F：5＇－CTGCAGCACTTGCATCAGGAACCTG－3＇R：5＇－GGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA－3＇Arg－1 F：5＇－CACCTTGGAGTTCACCCAGT－3＇R：5＇－CGAAGCAAGCCAAGGTTAAAGC－3＇IL－10 F：5＇－TGCTAACCGACTCCTTAATGCA－3＇R：5＇－TCATGGCCTTGAGACACCTTG－3＇GAPDH F：5＇－ACACTCAGACCCCCACCACA－3＇R：5＇－CATAGGCCCCTCCCCTCTT－3＇

1.3 BV2細胞的培養(yǎng)

以小膠質(zhì)細胞瘤BV2細胞系作為研究對象，將細胞置于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100U／ml青霉素及鏈霉素），以37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代，當細胞貼壁生長且狀態(tài)良好后按1×106／ml接種于6孔板。

1.4 BV2細胞實驗分組

BV2細胞分為生理對照組（加DMEM）、LPS處理組（1 ug／ml LPS 孵育24 h）、LPS 及高劑量Simvastatin共孵育 組（1 ug／ml LPS＋20 ug／ml Simvastatin）、LPS及低劑量Simvastatin共孵育組（1 ug／ml LPS＋5 ug／ml Simvastatin）四組。

1.5 ELISA 測定各組TNF－α、IL－12、IL－10水平

收集各組細胞經(jīng)刺激24h 后培養(yǎng)上清，按ELISA 試劑盒說明書檢測各組TNF－α、IL－12、IL－10水平，顯色后在酶標儀450nm 波長檢測吸光度（D 值），建立標準曲線并計算TNF－α、IL－12、IL－10水平。

1.6 RT－PCR 測 定iNOS、Arg－1、IL－10mRNA 的表達水平

按RNA 提取試劑盒說明書及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，分別提取各組細胞總RNA，Nano－Drop1000檢測RNA 的水平，采用TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量試劑盒檢測iNOS，Arg－1，IL－10mRNA 的表達，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）作為內(nèi)參對照。反應參數(shù)：95℃變性4 min；95℃30 s，55℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。分別評價的表達，每個樣本設(shè)3 個復孔。CT 值代表熒光實時定量PCR 值，ΔCT＝CT（目的基因）－CT（內(nèi)參基因），ΔΔCT＝ΔCT（實驗組）－ΔCT（對照組）。根據(jù)公式可以算出各組細胞中目的基因表達／對照組細胞中目的基因表達＝2－ΔΔCT。

1.7 流式細胞儀檢測BV2 膜蛋白CD206的表達水平

分別將各組BV2細胞棄去培養(yǎng)上清，離心收集細胞于2 mlEP 管中，調(diào)整細胞濃度約5×105／管，用PBS洗滌2次，100 ul PBS 重懸，分別加入小鼠FITC－CD206抗體，室溫避光孵育30 min 后，PBS洗3遍，用0.2 ml PBS重懸后，用流式細胞儀FACS Calibur（BD 公司）檢測各組細胞表面CD206表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 ELISA 分 析Simvasatin對 于BV2 細 胞 分 泌炎性因子TNF－α、IL－12及抑炎因子IL－10的影響

如圖1所示，LPS組BV2分泌炎性因子TNFα、IL－12含量均較生理對照組顯著增加（P＜0.05），而IL－10表達量較生理對照組無顯著差異（P＞0.01），而辛伐他汀高劑量及低劑量組較LPS 組TNF－α、IL－12含量明顯降低（P＜0.05），而抑炎因子IL－10分泌量較LPS組顯著增加（P＜0.05）。

圖1 各組TNF－α、IL－12、IL－10 表達水平 與生理對照組比較，＊P＜0.05；與LPS組比較，＃P＜0.05

2.2 RT－PCR 分析Simvasatin對于BV2細胞M1／M2 極 化 標 志 性 分 泌 因 子iNOS、Arg－1、IL－10mRNA 變化的影響

如圖2所示，BV2細胞M1型極化的標志分子iNOS在LPS 組均較生理對照組明顯增高（P＜0.05），而辛伐他汀高低劑量組iNOSmRNA 均較LPS組顯著降低，并且替代激活途徑M2型極化的標志分 子Arg－1、IL－10mRNA 均 較LPS 組 顯 著 增高（P＜0.05）。

2.3 流式細胞儀檢測膜蛋白CD206分析Simvasatin對于LPS誘導的M1型BV2細胞向M2型轉(zhuǎn)化的影響

如圖3 所示，BV2 小膠質(zhì)細胞絕大部分表達CD206蛋白（陽性率為90%～98%），但各組的表達強度存在顯著差異，生理對照組及LPS 刺激組CD206表達強度較低，其平均熒光強度（Mean）僅分別為29.72和33.49，而給予高低劑量的辛伐他汀后CD206作為M2型極化狀態(tài)標志蛋白其表達量明顯增加，熒光強度上升至66.06和70.40，上升幅度為2.1～2.2倍。

圖2 各組TNF－α、IL－12、IL－10 表達水平 與生理對照組比較，＊P＜0.05；與LPS組比較，＃P＜0.05

圖3 各組CD206表達

3 討 論

小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫效應細胞，在一系列神經(jīng)系統(tǒng)病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，其在體內(nèi)外均有著較強可塑性，在不同條件下可表現(xiàn)為促炎和抑炎促修復的雙重作用［3］。關(guān)于其來源，目前認為其與單核細胞是同源的，即腦內(nèi)單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞［5，6］。研究表明，巨噬細胞亦存在兩種極化途徑，即經(jīng)典激活M1型及替代激活M2型，M1型巨噬細胞分泌高水平促炎因子如NO、IL－6、IL－12、TNF－α等，其分子標志是CD16／32等；而M2型細胞則分泌IL－10、TGF－β等抑炎因子抑制M1型反應，發(fā)揮修復組織及重塑的功能，其標志物是精氨酸酶（Arg－1）及CD206等［7，8］，它們之間的鑒別也主要和通過對這些細胞膜分子及相關(guān)細胞因子的檢測來實現(xiàn)。同時，這些分泌因子也體現(xiàn)其功能表現(xiàn)，如Weber等研究發(fā)現(xiàn)醋酸格拉替雷可誘導單核細胞高分泌IL－10，而IL－12的產(chǎn)生減少，證實具有M2 表型的單核細胞可通過誘導調(diào)節(jié)性T細胞減輕EAE 的發(fā)?。?］。因此，本研究通過檢測TNF－α、iNOS、IL－12判斷BV2向炎性M1型極化，檢測IL－10、Arg－1、CD206判斷向抑炎M2型極化，共同評價BV2細胞極化狀態(tài)受到不同因素的影響。

他汀類藥物作為HMG－CoA 抑制劑是最重要的降指藥物之一，廣泛應用心腦血管疾病中抗動脈粥樣硬化的治療，近年大量研究發(fā)現(xiàn)其除降脂作用外還包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等，因而在治療免疫介導的疾病如多發(fā)性硬化、器官移植排斥等方面具有令人囑目的應用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，BV2細胞受到LPS誘導后其分泌促炎因子如IL－12、TNF－α明顯增加，而給予Simvastatin處理的細胞組促炎因子分泌減少，而抑炎因子IL－10分泌增多，這也證實了其抑制炎癥的免疫調(diào)節(jié)作用。在對小鼠EAE 動物模型研究中Youssef亦證實了他汀藥物能抑制EAE致病灶的復發(fā)及進展，也獲得了與體內(nèi)試驗相似的結(jié)論［10］。然而，關(guān)于他汀藥物抑炎機制的研究目前卻無定論，本研究通過對BV2細胞膜標志蛋白CD206的分析，觀察到Simvastatin處理組M2型極化細胞比例升高，M1型細胞比例有所下降，證實了Simvastatin對于小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)具有逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)作用，從而影響其參予的神經(jīng)疾病免疫反應，發(fā)揮其抑炎并促進組織修復作用，這很可能是其發(fā)生抑炎作用的重要機制之一。

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