周海燕 王寬松 胡忠良 何瓊瓊 李 勇 文繼舫

(1中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 長沙 410013;2湖南省兒童醫(yī)院普外科 長沙 410007)

在我國，胃癌的發(fā)生率和死亡率居惡性腫瘤之首［1］，浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要因素。探討胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族成員之一，其含量在這個(gè)家族中最高，具有代表性［2］。TGF-β1由2條均有112個(gè)氨基酸的相同多肽鏈經(jīng)二硫鍵相連的二聚體組成，相對分子質(zhì)量(Mr)為25 000，基因定位于染色體19q13．1。大量研究表明TGF-β1能夠促進(jìn)胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移［3］，其表達(dá)程度與胃癌的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［4－5］，但其機(jī)制尚不清楚。miRNA(microRNA)作為生物體重要的基因調(diào)控分子，其表達(dá)失控可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生并影響腫瘤的進(jìn)展。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)中，被 TGF-β1 磷酸化的 Smad5是miR-155的直接作用靶點(diǎn)［6］。TGF-β1 能夠上調(diào)miR-181b的表達(dá)，促進(jìn)肝癌的發(fā)生［7］。越來越多的研究表明 TGF-β1與 miRNAs相互影響、共同致?。?－10］。但是，TGF-β1 對胃癌細(xì)胞 miRNA 的調(diào)控作用國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究利用miRNA芯片技術(shù)，檢測TGF-β1作用后胃癌細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)，對其結(jié)果進(jìn)行初步分析，從miRNAs水平探討TGF-β1促進(jìn)胃癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為胃癌的臨床靶向治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

細(xì)胞株及其培養(yǎng) 人低分化胃癌細(xì)胞株BGC823、中分化胃癌細(xì)胞株SGC7901和高分化胃癌細(xì)胞株MKN28由中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系保存。細(xì)胞置于含10%胎牛血清(FBS，天津?yàn)蠊?的DMEM(美國Gibco公司)培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后繼實(shí)驗(yàn)。

TGF-β1對BGC823細(xì)胞的作用 各腫瘤細(xì)胞株經(jīng)過3次傳代后，待長至70%融合度時(shí)換液，BGC823和MKN28以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，SGC7901以含1%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，處理組加入 10 ng/mL的 TGF-β1(英國 PeproTech．EC公司)，分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h和36 h，然后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

總RNA的抽提和質(zhì)量檢測 根據(jù)說明利用Trizol法提取各組胃癌細(xì)胞的總RNA。用紫外分光光度計(jì)測定總RNA樣品在波長260 nm及280 nm處吸光度的比值(D260/D280)來確定其純度和濃度，確保比值為1．8～2．1。變性凝膠電泳分析提取的總RNA的完整性，觀察28 s、18 s、5 s條帶的寬度和亮度，以判斷RNA有無降解。

miRNA表達(dá)譜芯片檢測 本實(shí)驗(yàn)采用美國昂飛(Affymetrix)公司的GeneChip microRNA芯片，由北京博奧生物有限公司完成檢測。miRNA探針序列信息來自于Sanger miRBase miRNA database V11(http:∥microrna．sanger．uk)，針對每個(gè)人的 miRNA設(shè)計(jì)了847個(gè)探針，每個(gè)探針重復(fù)4次。向1 μg總RNA 樣品加入 500 μL 1 mmol/L Tris Cl和1 μL ATP mix，混勻，定容至 8 μL。加入 2 μL RNA Spike Control Oligos，得到 10 μL RNA/Spike Control混合物。向混合物中加入5 μL poly(A)Tailing Mix，將poly(A)尾巴連接至小 RNA 3'端，得到15 μL混合物，再將 4 μL 5×FlashTag Ligation Mix Biotin 和 2 μL T4 DNA Ligase加入上述15 μL反應(yīng)體系中得到21 μL混合物，將miRNA進(jìn)行生物素?zé)晒鈽?biāo)記?；旌衔?5℃溫浴30 min，加2．5 μL停止液終止反應(yīng)，獲得標(biāo)記好的miRNA體系。將芯片平衡放置于雜交爐(Hybridization Oven 640)中，48℃、60 r/min 旋轉(zhuǎn)16 h，進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交完成后，清洗、染色和掃描(Scanner 3000)，采集并將其進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。

芯片數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 使用GeneChip?Scanner 3000芯片掃描儀掃描，芯片圖像的原始熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)由 Affymetrix?GeneChip?Command ConsoleTM1．1處理，并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測本實(shí)驗(yàn)中篩選到的差異miRNAs的表達(dá)。選取差異表達(dá)的miRNA加以驗(yàn)證。Trizol抽提細(xì)胞總RNA，總RNA質(zhì)檢合格后，采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Invitrogen公司)以及實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)檢測差異表達(dá)的miRNA。內(nèi)參引物U6由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，miRNA特異性引物購自廣州復(fù)能基因有限公司(序列保密)，使用7 500實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增及結(jié)果分析。具體操作步驟如前所述［11］。

差異miRNA的生物信息學(xué)分析 miRNA靶基因預(yù)測運(yùn)用TargetScan軟件預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因數(shù)量和基因名，然后通過博奧生物分子功能注釋系統(tǒng) MAS(http://www．capitalbio．com/zhhans/support/MAS)，分析得出miRNA靶基因的相互關(guān)系圖，其翻譯蛋白的相互關(guān)系，參與的相關(guān)重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

總RNA質(zhì)量 對提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)定量，D260/D280為1．8～2．0。甲醛變性凝膠電泳條帶清晰，28 s/18 s RNA條帶灰度比值≥1．5，滿足miRNA芯片和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的要求(表1)。

表1 胃癌細(xì)胞株BGC823的總RNA定量結(jié)果Tab 1 Quantitative results for total RNA of BGC823 cells

miRNA芯片掃描和聚類分析結(jié)果 芯片經(jīng)過雜交、染色和清洗后，使用Scanner 3000進(jìn)行圖像掃描并將雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。TGF-β1處理0、24和36 h得到后胃癌細(xì)胞株BGC823 miRNA芯片掃描圖和差異miRNA聚類分析圖(圖1、2)。

圖1 TGF-β1處理后胃癌細(xì)胞株BGC823 miRNAs芯片掃描圖Fig 1 miRNA chip scanning pictures of BGC823 cells after treated with TGF-β1

圖2 TGF-β1處理0，24和36 h后胃癌細(xì)胞株BGC823差異miRNA聚類圖Fig 2 miRNA clustering figure of BGC823 cells after treated with TGF-β1 for 0，24 and 36 hours

表達(dá)譜和差異表達(dá)miRNA分析 本實(shí)驗(yàn)研究TGF-β1(10 ng/mL)處理后胃癌細(xì)胞株 BGC823 miRNA的差異表達(dá)。miRNA芯片實(shí)驗(yàn)選擇了0、24、36 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。24 h(或36 h)miRNA熒光信號(hào)強(qiáng)度值/0 h miRNA熒光信號(hào)強(qiáng)度值比值大于1．5(或小于0．66)視為差異表達(dá)。芯片信號(hào)強(qiáng)度24 h/0 h平均比值 ＞1．5表示上調(diào)，＜0．66表示下調(diào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理24 h后11 個(gè) miRNA(miR-502-3p，miR-574-3p，miR-30a，miR-30c-2，miR-34b，miR-193a-5p，miR-140-3p，miR-193b，miR-532-5p，miR-130b，miR-455-3p)的表達(dá)下調(diào)，5 個(gè) miRNA(miR-27a，miR-138-1，miR-29b-1，miR-194，miR-93)表達(dá)上調(diào)(表2)。作用36 h后11個(gè) miRNA(miR-1308，miR-574-3p，miR-23a，miR-1275，miR-181b，miR-181c，miR-193b，let-7b，miR-130b，miR-92b，miR-1246)表達(dá)下調(diào)，10 個(gè) miRNA(miR-212，miR-520c-5p，miR-29a，miR-301a，miR-224，miR-519c-5p，miR-27a，miR-29b-1，miR-192，miR-194)表達(dá)上調(diào)(表3)。而只有6個(gè) miRNA(miR-574-3p，miR-193b，miR-130b，miR-27a，miR-29b-1，miR-194)在處理24 h和36 h后有相同趨勢的變化(表4)。

表2 TGF-β1處理0 h和24 h后胃癌細(xì)胞株BGC823差異表達(dá)miRNAsTab 2 Differentially expressed miRNAs of BGC823 cells after treated with TGF-β1 for 0 or 24 h

表3 TGF-β1處理0 h和36 h后胃癌細(xì)胞株BGC823差異表達(dá)miRNAsTab 3 Differentially expressed miRNAs of BGC823 cells after treated with TGF-β1 for 0 or 36 h

表4 TGF-β1處理24 h和36 h后胃癌細(xì)胞株BGC823共有的差異表達(dá)miRNAsTab 4 The same differentially expressed miRNAs of BGC823 cells after treated with TGF-β1 for 24 or 36 h

差異表達(dá)miRNA實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證為驗(yàn)證本次miRNA芯片實(shí)驗(yàn)的可信度，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測了3株不同分化胃癌細(xì)胞株(SGC7901、BGC823和 MKN28)在 TGF-β1處理 24h后 miR-193b、miR-27a和 miR-130b 3條miRNA的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，在對TGF-β1刺激敏感株SGC7901、BGC823中實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR結(jié)果與芯片結(jié)果相比，雖然變化倍數(shù)不同，但變化趨勢一致(表5，圖3、4)，表明本次miRNA芯片結(jié)果可信。但是在TGF-β1抵抗性細(xì)胞株MKN28中，TGF-β1處理前后3個(gè)miRNA的表達(dá)水平未見明顯變化(圖5)。

表5 差異表達(dá)microRNA實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Tab 5 The verificated results of quantitative polymerase chain reaction(real-time RT-PCR)for differentially expressed microRNA

圖3 TGF-β1處理0和24 h后BGC823細(xì)胞株中miR-193b，miR-130b和miR-27a的表達(dá)水平Fig 3 The expression levels of miR-193b，miR-130b and miR-27a in BGC823 cells after treated with TGF-β1 for 0h or 24 h

圖4 TGF-β1處理0，24 h后SGC7901細(xì)胞株中miR-193b，miR-130b和miR-27a的表達(dá)水平Fig 4 The expression levels of miR-193b，miR-130b and miR-27a in SGC7901 cells after treated with TGF-β1 for 0h or 24 h

圖5 TGF-β1處理0，24 h后MKN28細(xì)胞株中miR-193b，miR-130b和miR-27a的表達(dá)水平Fig 5 The expression levels of miR-193b，miR-130b and miR-27a in MKN28 cells after treated with TGF-β1 for 0h or 24 h

miRNA靶基因的預(yù)測 選取miR-193b，miR-130b和miR-27a進(jìn)行靶基因預(yù)測。通過TargetScan軟件預(yù)測，共篩選出6個(gè)靶基因的生物學(xué)功能與胃癌的轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)(表6)。

表6 靶基因的預(yù)測Tab 6 The forecasts for target genes

討 論

miRNA是一類約19～24個(gè)核苷酸長度的單鏈非編碼小分子RNA。它們在細(xì)胞活動(dòng)、組織發(fā)生、個(gè)體發(fā)育及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮作用［12］。miRNA的失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生并影響腫瘤的進(jìn)展。因而，miRNA有望作為新的分子靶點(diǎn)運(yùn)用于腫瘤及其他疾病的分子靶向治療。

TGF-β1(10 ng/mL)處理后胃癌細(xì)胞BGC823具有更強(qiáng)的浸潤和轉(zhuǎn)移能力［2］，本文運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)檢測了TGF-β1處理前后胃癌細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的改變，發(fā)現(xiàn)6個(gè)miRNA出現(xiàn)了差異表達(dá)，這些上調(diào)或下調(diào)的miRNA可能與胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了miR-193b，miR-130b和miR-27a在3株不同分化胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。BGC823、SGC7901和MKN28 3株細(xì)胞均具有高水平表達(dá)的 TGF-β II型 Ser/Thr受體，對TGF-β1 刺激敏感［13－14］的 BGC823 和 SGC7901 細(xì)胞中，芯片的結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的結(jié)果一致，而 MKN28則由于 TGF-βⅠ型受體低結(jié)合活性［15］及 RUNX3 突變［16］表現(xiàn)為TGF-β1 刺激抵抗［17］。在 TGF-β1 處理前后 miR-193b，miR-130b和miR-27a均未見明顯改變。這些結(jié)果表明差異miRNA的改變由TGF-β1刺激所導(dǎo)致，而且可能經(jīng)由TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

查詢博奧生物分子功能注釋系統(tǒng)獲得miR-193b，miR-130b和 miR-27a預(yù)測靶基因 uPA、RUNX3和ETS1參與的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路和蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系。uPA基因(又名PLAU)定位于人類10號(hào)染色體的10q24，是一種絲氨酸蛋白酶，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。RUNX3基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型抑癌基因，與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的關(guān)系，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。RUNX3基因的不正常表達(dá)與胃癌、結(jié)腸癌、膽道腫瘤等消化道惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。ETS1基因是一種轉(zhuǎn)錄因子，MMP1作為轉(zhuǎn)錄因子ETS1的下游蛋白，是腫瘤血管生成中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移所必需的蛋白酶之一，研究表明在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，ETS1的表達(dá)與MMP1表達(dá)呈正相關(guān)［19］。

總之，這些芯片中差異表達(dá)的miRNAs，可能與上游或下游的分子相關(guān)，組成了一張基因-miRNA網(wǎng)，共同參與了浸潤和轉(zhuǎn)移的過程，具體作用到哪一個(gè)環(huán)節(jié)還有待于進(jìn)一步的研究。

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